肿瘤抑制基因p16和DNA甲基转移酶基因DNMT3b在胰腺腺癌细胞系和其它肿瘤细胞系中的表达.pfg.pdfVIP

中文摘要 ， f胰腺癌目前仍是一种难以诊断和治疗的疾病，它在导致死亡的恶性肿瘤中 排第五位。早期诊断困难、缺乏有效的治疗手段等等造成胰腺癌的预后非常差。 发展更为有效的诊断和治疗措施要求在细胞内的分子水平阐明胰腺癌的病理变 化。 嫂疸擅剑基国p16编码的蛋白质是一种关键性细胞周期调节蛋白，它能特 D的活性，使细胞周期阻滞于G1期。正常 异性抑制CDK4、CDK6和cyclin 胰腺导管上皮增生到发展成为导管内肿瘤直至导管腺癌的过程中，p16基因都 会发生改变，基本上是唯一一个贯穿病变全程的靶基因，可见其在胰腺腺癌中 的重要作用。p16几乎在所有的胰腺导管腺癌中失活，其中纯合性缺失和基因 内突变(包括错义突变、无义突变和移码突变)的比率差不多，大约均为40％ 左右，在剩下的病例中P16几乎全部因为启动子区域发生异常从头甲基化而失 活。 DNA甲基化是肿瘤中最常见的分子改变之一，包括基因组DNA总体甲 基化的水平降低和某些基因启动子区域发生异常从头甲基化。DNA的甲基化 过程由DNA甲基转移酶(DNMT)催化。已经在哺乳动物细胞中找到3个DNA 转移酶。DNMT2尚未发现具有甲基转移酶的活性。DNMT3包括2个基因： DNMT3a和DNMT3b，它们被认为是从头甲基转移酶，与肿瘤细胞中某些基 因启动子区域CpG岛的异常从头甲基化有关。人DNMT3b基因包含了3个选 择性剪接外显子(exon 构体。一般认为DNMT3b基因在肿瘤细胞中过表达。，V 一些实验室研究了肿瘤细胞中的DNA甲基化模式和DNA甲基转移酶表 达之间的关系。但是，各个小组的研究结果之间相互矛盾。本实验选取北京协 和医院病理科自建的5个人胰腺腺癌细胞系(P1、P2、P3、P4、和P7)、另 外7个肿瘤细胞系f人胰腺腺癌细胞系PANC．1、人宫颈上皮腺癌细胞系Hela、 管癌和癌旁正常配对组织做为实验材料，目的在于：(1)对肿瘤抑制基因p16 在自建的胰腺腺癌细胞系中的基本情况，包括缺失、突变、启动子和外显子中 DNA的甲基化状态、以及在mRNA和蛋白质水平的表达等等进行全面检测。 种选择性剪接mRNA在这些肿瘤细胞系中的表达。(3)比较这些肿瘤细胞系 中DNM’r3b基因的选择性剪接与P16基因启动子、外显子中DNA的甲基化 状态之间的关系。(4)比较DNMT3b基因各选择性剪接形式在乳腺浸润性导 管癌和正常对照组织中的表达是否存在差异。旨在通过以上一系列检测和分析 与他人结果相互印证，为探索胰腺癌的分子病理学机制提供一些线索和依据。 f研究发现；自建的5个人胰腺腺癌细胞系Pl至P7中，有两个细胞系(P4、 P7)、的p16基因发生纯合性缺失，而在所有5个细胞系中没有发现p16的基 水平全部没有表达。 10在p16阴性细胞系中的表达是p16阳性细胞系中的1．79倍；而选择性剪接 外显子exon 细胞系中的2．6倍；exon 21和exon22都表达的比例在p16阴性细胞系中是在 个选择性剪接外显子表达几率升高，而在P16基因存在的情况下，表达缺失的 几率升高，看来P16和DNMT3b是相互排斥的。由于一个基因发生改变消除 了同一途径中另一个基因改变的需要，所以它们可能在同一条途径中起作用。 进～步推论，可能是DNMT3b的从头甲基化活性使肿瘤抑制基因P16的启动 子CpG岛发生异常从头甲基化而失活，成为P16失活的3个原因之一。但是 目前尚缺乏明确有力的依据，需要进一步研究分析。 在自建的5个人胰腺腺癌细胞系和另外7个肿瘤细胞系共12个细胞系中， 平很低，肿瘤细胞似乎不需要DNMT3b的从头甲基化活性来提供另外的选择 性生长优势。另一种可能是DNMT3b的DNA从头甲基化活性是非常高效的， 即使少量表达就可以造成肿瘤细胞和正常细胞中DNA甲基化模式的差异。但 是不能确定肿瘤细胞为什么表达大量没有功能的DNMT3b蛋白质。也许细胞 会根据生长需要调节不同成分的表达比例：也许简化的DNMT3b蛋白质具有 另外的功能。 在本组12个肿瘤细胞系中，有5个细胞系的P16基因在第一外显子中存 10，而 外显子中没有发生DNA甲基化的细胞系没有一例(0／4)表达exon10。选择 性剪接外显子exon21和exon