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硕士论文 角膜移植排斥反应相关的泪液蛋白组学研究 摘要 第一章l大鼠角膜移模型的建立和排斥反应相关蛋白组学分析 目的 建立大鼠自体移植模型和异体移植模型，通过同位素标记相对和绝对定量技术 (iTRAQ)为基础的蛋白质组学研究筛选出与角膜移植排斥发生、发展相关的差 异蛋白，并运用生物信息学技术，分析其与角膜移植排斥反应可能相关的机制， 为进一步发展新的排斥反应监测、预防、治疗手段奠定基础。 材料和方法 i．成年Wistar大鼠42只，随机分为三组，分别对右眼行同种异基因角膜移植 (SD大鼠为供体，Wistar大鼠为受体)，同种同基因角膜移植(自体原位角膜移 植)及空白对照。 2．术后每天观察植片水肿、浑浊和新生血管情况。 3．术后2、7、14天收集各组大鼠泪液，每只约10ul，冻存于80℃以备后用。 4．将大鼠泪液样本离心后取上清液，经多重吸附去除系统(MARS)去除高丰度 蛋白。然后对这些泪液标本进行蛋白提取、定量和酶解。 16 5．iTRAQ八标试剂标记后(113标记空白对照组，115标记异体移植组2d，i 自体移植组7d，121标记自体移植组14d)，进行二维液相色谱一串联质谱 (2DLC—MS／MS)分析。 6．利用ProteinPilot软件进行搜库并定量。差异表达蛋白界值设定：大于2 为显著上调(pO．05)，小于0．5为显著下调(pO．05)。 7．观察各组间蛋白表达的差异和各组内不同时间点蛋白表达的差异。对各组和 各时间点差异表达的蛋白进行生物信息学分析，包括分层聚类分析、G0分析和 通路分析，寻找角膜移植排斥反应相关的差异蛋白。 结果 1．角膜移植术后，除术后2天两组大鼠角膜植片浑浊度没有统计学差异外 (p=0．123)，其余角膜植片在各时间点浑浊、水肿、新生血管及RI值差异有显 著性(p0．05)。 个时间点发生显著上调／下调的蛋白分别为：35个、36个、31个。 3．在异体移植组中，G0分析发现神经系统调节、自由基的清除、细胞的死亡 与存活、细胞运动富集度较高；pathway分析显示LXR／RXR的活化、急性时相反 应信号通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路和肌动蛋白细胞骨架信号通路富 万方数据 硕士论文 角膜移植排斥反应相关的泪液蛋白组学研究 集度较高。与自体移植相比，异体移植富集度显著增高的通路有：LXR／RXR的活 化通路、网格蛋白介导的内吞作用信号通路。 4．Coronin-iA在异体移植组中明显高于自体移植组。在异体移植组中，其在排 斥开始发生时即7d达到峰值，而在自体移植组中，其随时间推移逐渐降低。 5．Vitamin-D bindingprotein(DBP)在移植组第14天明显上调。 结论 1． Itraq为我们从整体上了解角膜移植排斥发生、发展过程中蛋白质的差异表 达，从而筛选出有意义的蛋白提供了良好的平台。对样本量小、极性蛋白、及酸 性碱性蛋白具有很高的检出率，可信度高，可重复性强。泪液样本的收集对眼局 部和全身无影响。由于泪液样本量较少，选用itraq技术对泪液中蛋白质的检测 具有很高的效率。 2．生物信息学的方法可以扩展思路和视野，有助于我们进一步从整体上了解差 异表达蛋白的功能和调控。本研究提示参与神经系统调节的蛋白与植片的排斥相 关，而参与氧自由基的活化的蛋白与角膜内皮细胞凋亡以及白细胞积聚、免疫损 伤和新生血管的形成相关。LXR／RXR通路可能通过影响脂质代谢、葡萄糖代谢和 巨噬细胞相关基因表达影响植片的存活。肌动蛋白细胞骨架信号通路参与免疫细 胞的趋化移行、抗原识别、信号转导、免疫突触形成、活化、增殖分裂等过程， 从而影响免疫排斥反应。 3．Coronin-iA可能是排斥发生早期有意义的生物学标记物，它通过影响T细胞 的迁移和T细胞与APCs相互作用参与排斥反应的发生。 4．DBP可能通