三核苷酸短链重序列扩展合成特性及其机理研究.pdfVIP

谨以此论文献给一直给予我悉心指导的梁兴国教 授及关心支持我的家人、朋友 ！ 王阳 摘 要 三核苷酸短链重复序列扩展合成特性及其机理研究 摘 要 简单重复序列在各种生物基因组中广泛存在，同分子进化、遗传多样性、分 子标记和某些遗传性疾病等密切相关。其中以对三核苷酸重复序列的研究居多， 但大多只是作为一种较为异常的现象或是针对一些遗传性疾病而进行的独立研 究，比较零散，且对于机理的探讨也较为肤浅。本研究以全部 64 种 18 碱基的三 核苷酸单链重复序列以及它们两两配对形成的 32 种双链重复序列作为研究对 象，对它们在聚合酶作用下的恒温扩展合成进行了系统研究。探讨了反应温度、 序列本身、DNA 聚合酶种类和浓度等一系列因素对扩展效率和产物长度的影响， 发现三核苷酸具有普遍的恒温扩展特性，且单链和双链扩展情况截然不同，在此 基础上还初步探讨了外源序列对重复序列扩展的抑制作用。 除单一碱基组成的短链外，其他所有单链重复序列在合适的温度都能扩展。 总体而言 GC 含量较多的短链大部分扩展效率较高，短链的最适扩展温度与 GC 组成呈一定的正相关关系。短链扩展速度极快，反应 1-4 h 即有长达数十碱基对 - 以上的长链产物出现。在低至 5 U/mL 的Vent(exo )DNA 聚合酶及 1 nM 的低浓 度短链条件下，扩展能力依然较强，说明短链重复序列具有极易扩展的特性。用 具有特定识别位点的限制性内切酶对扩展产物进行酶切，发现产物能被完全切 开，说明产物中含有大量的特定重复序列。产物经测序表明确由大量的三核苷酸 自身重复和互补重复组成。在此基础上提出了可能的扩展机理。 o 对于双链的恒温扩展研究发现，在 70 C 恒温条件下，Vent DNA 聚合酶能促 使双链发生扩展反应，绝大多数产物单一性良好。该反应能在较宽的温度范围内 o 发生，例如即使在 37 C 的常温下耐热性聚合酶仍能催化(AAA) /(TTT) 发生扩展 6 6 反应，且在一定范围内产物分子量大小随反应时间线性增加，线性良好。序列组 成对短链的扩展也具有一定影响，GC 含量为 1/3 的序列具有较高的生成速率， 基本上能在 4.0 h 的扩展反应后得到2.0 kb 以上的产物，扩展速率达到 8.0 bp/min 以上。当产物增大到一定程度时，扩展明显减弱，产物分子量增长减缓。随着反 应温度升高，产物差异性增大。酶切扩展产物表明产物由大量自身重复和互补重 复单位组成。最后分析了双链重复序列的―复制滑移‖扩展机理，有望为进一步研 究重复序列的分子进化和基因检测中的非特异性扩增等提供支持。 I 摘 要 在探讨外源序列对重复序列的影响时，研究表明外源非重复序列对短链重复 序列的恒温扩展具有一定的抑制作用。添加的外源DNA 浓度达到 100 nM 以上 即可完全抑制其非正常扩展。加大反应体系中DNA 聚合酶的量，抑制作用得到 一定程度解除，表明产生抑制的原因可能在于外源非重复序列与短链重复序列在 体系中结合聚合酶时处于竞争关系，而外源序列能够优先与聚合酶结合。以上结 果为进一步研究抑制重复序列非特异性扩展提供借鉴。 关键词：三核苷酸重复序列，重复序列，非特异性扩增，分子进化