曲霉cj22-26产壳聚糖酶基因的克隆、表达与定点突变.pdfVIP

摘要 摘要 壳聚糖酶可以专一性地水解壳聚糖，生成在很多领域都有着广泛应用的低聚壳聚 糖。但是已报道的微生物产壳聚糖酶的酶活力普遍较低。本实验室从大海淤泥中成功筛 选到了一株产壳聚糖酶菌株曲霉CJ22．326。此菌株可以在壳聚糖诱导培养基中产内切壳 聚糖酶(CSN)和外切壳聚糖酶(csx)。为了进一步提高壳聚糖酶的活力，本研究运用分子 生物学的方法，对酶的基因进行了克隆和表达并对重组酶进行了定点突变研究。 NS8，以基因组DNA为模板，PCR扩增得到了曲霉的18srDNA序列。对PCR产物进行鉴 定和测序， 结果发现CJ22—326与曲霉属的Aspergillus 青霉属的Penicillium KCTC6052等菌株的相似性均 expansum和Penicilliumchrysogenum 达到了96％。但是根据孢子形态特征，发现它不属于其中任何的菌种，我们认为它是曲 霉属的新菌种。 ofcDNA 利用3-RACE(rapidamplificationends)和5-RACE的方法，使用简并引物， 基因(717 的外切壳聚糖水解酶的编码序YU(2652bp)。该序列已在Genbank数据库申请登记，登记 号为FJ449570。 将内切壳聚糖酶和外切壳聚糖酶的eDNA结构基因分别插入到大肠杆菌表达载体 kDa的蛋 白表达带。采用不同的温度和IPTG诱导浓度，对重组内切酶的表达条件进行了优化。 发现当温度为37℃，IPTG诱导浓度为1mM时，蛋白质的表达量最高。重组质粒 pET28a-CSX转化大肠杆菌BL2 组外切酶，SDS．PAGE和Westem．blot检测到约100kDa的蛋白表达带。使用Ni．NTA 亲和层析对重组内切酶和重组外切酶进行了亲和纯化，分别得到了2．3 mg／L和1．2mg／L U／mL 蛋白质。使用DNS法对重组内切酶和重组外切酶的酶活力进行了测定，分别为1．18 和6．96U／mL。 通过测定酶解液体系的粘度和对酶解产物的薄层层析分析，发现重组酶CSN以内 切的方式水解壳聚糖的D．(1，4)糖苷键。而重组酶CSX是以外切的方式作用于壳聚糖的 分子一端，依次切下氨基葡萄糖残基。对重组酶的酶学性质进行研究，结果表明：重组 内切酶的最适pH值是6，最适反应温度是65℃，‰和‰缸分别为0．826mg／ml和0．094 摘要 0．146 mg／ml·min和7．758mg／ml。重组内切酶和重组外切酶具有高度的底物专一性，除 了对不同脱乙酰度的壳聚糖有作用以外，对几丁质和CMC没有水解活力。两者的反应 速率均随着底物脱乙酰化度的提高而增加。 运用定点突变的方法，对保守的谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)进行定点突变后，发现 突变酶的二级结构进行研究，发现E169Q的结构和野生酶以及其它保持一定活力的突 变酶(D160E)基本保持一致。 关键词：曲霉；内切壳聚糖酶；外切．p．D．氨基葡萄糖苷酶；克隆；表达；His—Tag纯化； 定点突变 II Abstract Abstract Chitosanases chitosaninto have VariOUS hydrolyze chitooligosaccharides，which