逆转座子atr诱导元帅系苹果短枝变异分子机理的初步研究.pdfVIP

摘要 前期研究表明逆转座子atr1参与了苹果元帅系的短枝变异，为揭示其变异机理， atr1-LTRs IPCR atr1 IRAP-PCR 本研究借助已获得的 和 技术分离了 部分序列；利用 在元帅系短枝变异品种中分离出一条特异性片段，并以此为切入点，在 “元帅”短枝 变异品种中获得了特异片段的部分侧翼序列，序列比对结果表明四个短枝变异品种中 特异性片段相同，本研究为揭示逆转座子诱导苹果短枝变异机理提供了基础。 1、逆转座子atr1-LTRs部分侧翼序列。根据前期获得atr1-LTRs的500bp片段， 利用IPCR分离其侧翼序列。借助atr1-LTRs设计两对反向引物，利用限制性内切酶 Hind DNA T4 Ⅲ对 “玫瑰红”基因组 进行充分酶切后，用 连接酶将酶切片段连接成 环作为PCR模板。两轮巢式PCR后，测序得到一条片段大小为1896bp。将该片段与 先前的atr1-LTRs片段拼接后设计验证引物，在 “玫瑰红”基因组DNA 中进行扩增， 2124bp RT 最终测序得到一条 的片段。分析表明其中包含了 “逆转录酶基因 （ ）的部 分片段、RNaseH和3’-LTR部分及其侧翼序列”。 2、基于atr1 的苹果元帅系短枝变异品种特异性片段的分离。以苹果“元帅”及 1 DNA 其短枝变异品种 “华帅 号”、“矮红”、“奥勒冈矮生”和 “玫瑰红”的基因组 为模板，利用atr1-LTRs设计引物，根据优化的IRAP-PCR体系和程序，扩增出 “元 帅”及其短枝变异品种指纹图谱，并分离出一条差异条带。测序结果中，“华帅1号” 809bp 758bp Hs1 Hs1 得到两条长度分别是 和 的特异片段，命名为 和 ’，“矮红”、“奥 勒冈矮生”和“玫瑰红”品种分别得到了一条长度为809bp的特异片段，命名为Ah1、 Alg1和Mgh1。在此基础上，每条特异片段设计一条较长的引物，分别在“元帅”及 其短枝变异品种进行验证，成功将IRAP标记转化为SCAR标记。 3、TAIL-PCR分离元帅系短枝变异品种中特异片段的侧翼序列。先根据Mgh1 设计三条巢式特异引物，与简并引物相结合，优化了三轮PCR扩增体系和程序，得 到测序结果后与Mgh1序列拼接并设计验证引物，在“元帅”及其短枝变异品种扩增， 得到特异片段Hs2、Ah2、Alg2和Mgh2。再根据Hs2设计三条巢式特异引物，与简 并引物相结合，经过三轮PCR扩增，得到测序结果后与Hs2序列拼接并设计验证引 Hs3 Ah3 Alg3 Mgh3 物，在“元帅”及其短枝变异品种扩增，最终得到特异片段 、 、 和 。 关键词：苹果 逆转座子 IRAP标记 反向PCR 热不对称交错PCR I Abstract Partial sequences of Ty1-copial-like retrotransposon atr1 in apple genome, which could be activated under stress conditions, were isolated usin the lon terminal repeat sequence in atr1 (atr1-LTRs)by IPCR technique. The