stlv-1b重组蛋白elisa诊断试剂盒的研发及液相芯片诊断方法的建立.pdf

摘 要 感染率比较高，这不但影响动物健康和实验研究的结果，而且对实验接触人员具有严 重危害性。目前，分离、细胞培养病毒作为抗原是诊断这两种疾病常用的方法，这对 实验人员有严重的危害性，而且成本相对较高。为了获得更多的、对实验操作人员没 单纯疱疹病毒(BV)gd部分保守基因片段，经大肠杆菌的表达、亲和层析纯化，建 的液相芯片技术，这为以后的进一步实验奠定了基础。 本研究根据Genbank公布序列化学合成STLV-lgag、BVgd基因片段，经酶切后 将目的片段连接到表达载体pETl5b中并进行测序鉴定。再将重组质粒转化到表达宿 Blot检 测表达量及表达活性，经蛋白质活性鉴定及大小均正确的菌株进行大量(IOL)发酵、 纯化得到重组蛋白STLv-1gag和重组蛋白BVgd。然后以重组蛋白作为抗原检测猴 血清中相应抗体，并与现有商品化诊断试剂盒结果对比。同时，将重组蛋白STLV一1 gag、重组蛋白BVgd作为探针偶联到不同颜色(即不同编号)的荧光微球上对恒河 猴血清中相应的抗体进行检测，检测结果与ELISA检测结果进行对比。经研究得到如 下结果： 1．从化学合成的pJ—STLV一1gag、pJ-BVgd载体经酶切获得了目的片段STLV-1gag (1323bp)，BVgd(1 表达质粒pETl5b—STLV—lgag、pETl5b—BVgd。 DE3 2．经鉴定正确的重组质粒转入表达宿主rosetta2plysS中，小量诱导表达STLV-1 Blot检测表达量及表 gag、BVgd，优化诱导表达条件后进行SDS、Western 达活性。结果表明，重组蛋白STLV-1 gag、重组蛋白BVgd在大肠杆菌中成功表 达，STLV-1 gag重组蛋白以可溶形式存在于菌体中，BVgd重组蛋白以包涵体的形 式存在。 3．IOL发酵罐大量诱导大肠杆菌表达重组蛋白STLV-1 gag和重组蛋白BVgd，然后经 AKTA纯化系统Ni2+亲和层析纯化得到重组蛋白STLV-1 gag和重组蛋白BVgd。 4．以重组蛋白STLV-1 gag为抗原检测广西某猴场1304份恒河猴血清，阳性率为 3．76％，重组蛋白BV gd作为抗原检测514份恒河猴血清，阳性率为29．96％；现有 商品化诊断试剂盒检出阳性率分别为2．68％、21．60％。经WesternBlot确认检测 结果，重组蛋白检出率明显高于现有商品化诊断试剂盒(P0．05)。因此重组蛋白 STLV—l gag和重组蛋白BV gd可以作为病毒良好的代替抗原，解决了通过分离、 培养病毒获取抗原的困难以及操作的危险性。同时，为猴群的净化、SPF实验用猴 的保证提供了一种廉价、快速、准确、有效的ELISA诊断方法。 5．对比ELISA与流式荧光微球检测结果，证明用荧光微球对猴血清进行检测，不仅比 灵敏、方便快速、高通量的荧光微球诊断技术，在一个反应体系中可以同时检测多 个指标，这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞跃。 关键词： STLV-1；BV；重组蛋白；ELISA：LUMINEX on RecombinantProtein ELISAkits STLV一1＼BV Study Diagnostic and Established LiquidChipDiagnoseTechnology