10种致脑炎病的基因芯片检测方法建立.pdf

摘要 过叮咬的方式将病毒传播给人畜等哺乳动物，从而引起人畜严重疾病的一类病毒。虫媒病毒包括 黄病毒科、披膜病毒科、布尼亚病毒科等14个病毒科的540余种病毒，其中，我国已分离到9 种，证实在我国流行的病毒有4种，分别为流行性乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、新疆出血热病 毒、登革病毒，其中，乙型脑炎病毒和森林脑炎病毒被国家列为法定报告传染源。近年来，随着 国际化进程加快，境外虫媒病毒传入我国的可能性显著增加，因此，快速准确的检测虫媒病毒在 传染病防控上有重要意义。 基因芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的一种多学科交叉的新技术，具有高通量、高 JEV)、 度平行性、自动化等特点。本研究是以流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus9 森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitisvirus9TaEV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)、狂犬病毒 (Rabies nile vi№RV)、西尼罗病毒(Westvirus9WNV)、东方马脑炎病毒(Eastern equine virus，EEEV)、西方马脑炎病毒(Westernvirus，WEEV)、基肯孔雅 encephalitis equineencephalitis ferver 病毒(Chikungunyavirus,CHIKV)、裂谷热病毒(Riftvalley RVFV、NiV的寡核苷酸基因芯片，用于对以上10种脑炎病毒进行快速、早期检测。本课题的研 究将用于检测10种致脑炎的人兽共患病病毒，对防止外来病原入侵，减少病毒对人类健康和畜 牧业发展的危害，有着重要的社会意义和经济价值。 EEEV全基因组序列和所构建的质粒RVFV、NiV的序列，通过DNAStar和DNAman等生物分 析软件进行多序列比对分析，选择了高度保守区域设计寡核苷酸探针，每种病毒设计1．2条探针， 6．0和Primer 5．0引物设计软件，在该 毒基因组的同源性不得大于50％。同时应用Oligo premier 保守区域内，针对上述10种病毒共设计了15对特异引物，用于病毒靶核酸的多重PCR扩增。 醛基化修饰的玻片上，以制备检测芯片。 提取待检病毒RNA进行随机反转录，用15对特异引物经优化组合后共设立四个多重PCR 多重PCR反应体系标记勰司U，rP后通过耦联Cy蹦5荧光染料分子用于芯片进行杂交反应。 通过对杂交条件进行优化，最终确定点样探针浓度为30I．tM，最佳杂交液浓度含有400,6甲酰 胺，最佳杂交温度为45C，最佳杂交时间为2h。利用优化后的杂交条件，对基因芯片进行有效 性、重复性、特异性、敏感性验证。用上述10种病毒的PCR扩增产物混合后进行芯片杂交，结 果表明，在所有病毒探针位点均可以看到明显的检测信号，而阴性对照信号较弱或没有信号，说 明该检测方法有效性良好。从三批不同时间制备的芯片中各随机抽取2张，用于验证芯片的稳定 性与重复性，杂交结果显示，无论是同一批次之间的芯片还是不同批次之间的芯片，杂交效果理 感病毒(H1N1)进行非特异性验证，结果表明，没有非特异信号产生，说明该检测方法特异性 良好。通过对TBEV、JEV、RV最低检测病毒量和最低检测拷贝数进行该方法的敏感性试验，结 X 果表明，对TBEV最低检测病毒量为87 10l、 TCID