免疫胶体金技术速检测大肠杆菌o157和志贺毒素.pdf

上海交大硕士论文 摘 要 免疫胶体金技术快速检测大肠杆菌O157 和志贺毒素 摘 要 大肠杆菌O157是产志贺毒素大肠杆菌（Shiga-producing Escherichia coli, STEC ） 的主要血清型，可以引起人和动物的腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征、血 栓性血小板减少性紫癜。志贺毒素（Shiga toxin，Stxs ）是大肠杆菌 O157 的主要毒 力因子之一，有两个生物型：Stx1和Stx2 ，只产生Stx2的菌株毒力比只分泌Stx1和两 者同时分泌的菌株毒力都强。Stx2致病剂量极低，且分泌胞外，Stx2 的检测将直接有 助于对分离菌株致病力强弱的判定，提高对高致病性大肠杆菌O157菌株的检出。因 此本课题研究大肠杆菌O157和Stx2 的胶体金层析法( Assay, GICA)，进行高致病性大肠杆菌O157菌株检测和鉴定，以便更好的预防和控 制大肠杆菌O157所致的人和动物的疾病。 将本实验室构建的重组Stx2B亚单位的质粒pGEX-Stx2B转化入大肠杆菌BL21 ， 然后采用PCR和酶切进行鉴定，将阳性转化菌进行重组蛋白的表达、鉴定、纯化， 用纯化的融合蛋白多次免疫新西兰大白兔制备抗重组Stx2B的多克隆抗体。同时用大 肠杆菌O157 ATCC43889全菌体抗原多次免疫新西兰大白兔，制备抗大肠杆菌O157 多克隆抗体。 用硫酸胺法、辛酸-硫酸胺法、Protein G亲和层析3种方法分别纯化制备的多克隆 抗体，结果表明：Protein G法纯化的抗重组Stx2B IgG纯度较其前两者纯，其金标多 抗的稳定性较好，辛酸-硫酸胺法纯化的抗大肠杆菌O157 IgG的活性较Protein G纯化 的好，其金标多抗的稳定性较好，因此本试验采用Protein G法纯化抗Stx2B 血清，用 辛酸-硫酸胺法纯化抗大肠杆菌O157血清。 根据试纸条的侧向流动和胶体金的示踪功能，结合免疫学原理，分别建立并优 化了检测大肠杆菌O157和Stx2的双抗体夹心免疫胶体金方法。测定了胶体金颗粒的 最优化反应体系：胶体金颗粒的大小为20nm ；抗体与胶体金溶液结合的最佳pH约为 8.2；最佳蛋白结合量分别为抗大肠杆菌O157 IgG为57µg/mL ，抗重组Stx2B IgG为 III 上海交大硕士论文 摘 要 60µg/mL ；最佳稳定剂为BSA；最佳缓冲液为pH8.2硼酸溶液；最佳金标保存液和洗 涤液为5mM NaCl- 1%BSA的pH 8.2 的硼酸缓冲液；NC 膜的封闭液为3 ％BSA的 0.01mol/L PBST；Stx2试纸条和大肠杆菌O157试纸条的质控线（C线）上的羊抗兔IgG 的多克隆抗体最佳点样量均为1µg，其检测线（T线）的抗Stx2 的单克隆抗体的点样 量为0.1µg、抗大肠杆菌O157 的单克隆抗体的点样量为1µg，结合垫上的金标抗大肠 杆菌O157和重组Stx2B多克隆抗体点样量均为3µg。 用已建立的大肠杆菌O157免疫层析法对实验室保存的58株已鉴定的菌株进行检 测，与血清凝集实验结果相比较，其阳性检出率的符合率达87.5% ，检测下限为 5 10 CFU/mL ，显色时间为3～5分钟，阳性检出率的批内平均变异系数为2.1%，阳性 检出率的批间平均变异系数为6.9%。用已建立的Stx2 免疫层析法对实验室保存的58 株已鉴定的菌株进行检测，与Vero细胞毒性实验相比较，其阳性检出率的符合率为 50%，显色时间为5～10分钟，阳性检出率的批内平均变异系数为2.6% ，阳性检出率 的批间平均变异系数为28.85% 。大肠杆菌O157试纸条的特异性、重复性和敏感性较 好，大肠杆菌O157免疫胶体金试纸条转化为商用试纸条是可行的。Stx2免疫胶体金 试纸条在抗体效价、敏感性方面还需进一步优化，以提高阳性检出率和重复性。 关键词：大肠杆菌O157 ；Stx2 ；免疫胶体金层析法；抗体纯化；反应体系；检测