兔出血症病毒亚因组在昆虫细胞中的表达及其免疫原性研究.pdfVIP

摘 要 兔病毒性出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗称“兔瘟”，是 由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急 性、烈性、致死性传染病。兔出血症病毒的主要结构蛋白是由ORF1 编码的聚合 多肽裂解而来，分子量约为 60ku, 又被称为 VP60 蛋白，该蛋白是兔出血症病 毒最重要的免疫原蛋白。除了VP60，RHDV 基因组还编码一种分子量约为 10ku 的次级结构蛋白，又称为VP10 蛋白。研究证实，在RHDV 感染细胞中除了基因 组RNA 外，还存在大量的亚基因组mRNA，它们的翻译产物是病毒结构蛋白的重 要来源。大量研究资料表明，RHDV 基因组（包括亚基因组）的非编码区对病毒 蛋白的翻译与表达具有重要调节作用，此外VP10 的表达对于VP60 的表达和组 装还具有促进作用。鉴于此，本研究拟利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达 RHDV 的亚基因组mRNA,期望在非编码区和VP10 的扶助下，高水平表达兔出血症 病毒的VP60 蛋白，解决单一表达VP60 产量偏低的问题，为下一步研发抗RHDV 感染的多肽疫苗奠定基础。 首先，我们分别构建了 pFast-sgRHDV （RHDV 亚基组 mRNA ）和 pFast-sgRHDV∆Vp10 （缺失VP10 编码区的RHDV 亚基组mRNA）重组载体，经过 蓝白斑筛选获得穿梭质粒Bacmid-sgRHDV 和Bacmid-sgRHDV∆Vp10，转染Sf9 细 胞，发现两种穿梭质粒都可以在Sf9 细胞内进行增殖，并产生细胞病变。Western blot 检测结果证实，含有完整亚基组mRNA 基因的表达载体转染细胞后，VP60 蛋白的表达量远高于缺失VP10 亚基组mRNA 表达染细胞后VP60 蛋白表达量，这 一方面证明亚基因组在昆虫细胞中能够高水平表达病毒的结构蛋白，另一方面 也证明VP10 确实对VP60 的表达具有调节作用。 电子显微镜检测结果证实，在昆虫细胞中表达的RHDV 结构蛋白VP60 能够 自聚形成病毒样颗粒（virus like particles, VLPs）。由于VLPs 类似完整的 RHD 病毒粒子，能够模拟病毒激发宿主的免疫系统，产生特异性抗体，同时又 因为不含有病毒基因组而十分安全。因此，病毒样颗粒是研发多肽疫苗的最佳 候选免疫原。本文即将昆虫细胞表达的 RHDV VLPs 免疫试验兔，然后检测它诱 导的免疫应答水平。研究结果发现，用VLPs 免疫兔子后，不但可以激发高水平 的体液免疫，而且可诱导机体的细胞免疫。我们使用RHDV 强毒对试验兔进行攻 击，发现所有免疫兔均得到良好的保护。 本试验为进一步研制安全、有效的抗RHDV 感染的多肽疫苗奠定了基础，同 时也为研究RHDV 亚基因组的表达和调控机制提供了有益材料。 关键词：兔病毒性出血症；亚基因组；VP60 蛋白；杆状病毒；多肽疫苗 The Study of expression and immunogenicity of rabbit hemorrhagic disease virus subgenome in the insect cell Abstract Rabbit hemorrhagic disease (RHD) is a highly contagious and lethal infection that affects both wild and domestic rabbits. Its etiological agent, the rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV), is considered to be the single most economically important disease of rabbits worldwide. The disease was first recognised in China but was subsequently isolated in other areas of Asia, different Europe