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四醚脂质体作为口服载体的研究 摘 要 生物大分子药物如蛋白、核酸等口服给药的生物利用度相当低， 其原因之一在于蛋白或核酸等分子在苛刻的胃肠道环境中很不稳定， 极易被胃肠道的酸性环境，多种蛋白酶，以及胆汁盐所降解。为了避 免蛋白或核酸药物遭受胃肠道中的攻击，研究人员选用不同载体来保 护这些生物活性药物。 脂质体由于大小、表面电荷以及膜流动性的可控，作为口服载体 的研究备受青睐。以酯键构成的普通脂质体，能够装载多肽或核酸药 物，并对它们具有一定的保护作用。然而，普通脂质体作为口服输送 载体，仍然面临的最大障碍之一就是：它们在肠道胆汁盐的作用下极 不稳定，尤其是胆汁盐与肠道酶协同作用时。因此，我们期望寻求更 加稳定的脂质体以口服输送生物活性药物。 古细菌脂质体是脂质体的一种，是由古细菌细胞膜上提取的脂质 组成。古细菌脂质包括二醚脂质和四醚脂质。四醚脂质的核心部分就 是由 40 个碳原子构成的饱和类异戊二烯侧链并通过醚键与甘油骨架 的 2 、3 位碳原子相连接。而普通脂质体中的磷脂侧链是由不饱和脂 肪酸链组成，并以酯键与甘油骨架的 1、2 位碳原子相连接。另外， 由四醚脂质形成的脂质体的膜是由多个具有单分子层跨度的醚脂组 成，这种独特的结构给予四醚脂质体稳定的特性。 本研究就是从古细菌 Sulfolobus acidocaldarius 提取四醚脂质 i PLFE ，考察由PLFE 制备的四醚脂质体的体外稳定性特征，并着重评 价了四醚脂质体作为口服疫苗载体在诱导粘膜免疫、系统免疫和细胞 免疫中的作用以及作为多肽药物（胰岛素）的口服输送载体在糖尿病 小鼠中的降血糖效果。最后结合小动物成像等技术初步分析了四醚脂 质体口服后的在胃肠道中的滞留情况。本论文研究的主要内容及结果 总结如下： 收集生长成熟的古细菌 S. acidocaldarius ，成功的分离纯化得到 醚脂，并通过薄层层析分析、质谱分析、红外光谱分析以及核磁共振 分析进行表征。分析结果均表明我们提取、分离和纯化得到的脂质为 极性醚脂—PLFE 。 我们以薄膜分散法制备四醚脂质体，并通过原子力显微镜对其进 行形态表征，结果显示四醚脂质体外形成球形或近球形，分散效果好； 颗粒边缘清晰且平均直径大小为 210 nm 左右。这个结果也与激光粒 度测定仪测定的结果一致。而且，Zeta 电位测定仪测得四醚脂质体的 表面电荷为-35.1 mV，这样的电位使四醚脂质体具有好的分散性，不 容易聚集。作为多肽药物和疫苗的口服载体，具有良好的稳定性特征 是极其重要的。本研究中我们以钙黄绿素为渗透标记物，并模拟人的 肠道环境在体外考察了普通脂质体和四醚脂质体对钙黄绿素的释放 情况。结果表明：与普通脂质体相比，无论在模拟的肠道环境溶液中， 由PLFE 制备的四醚脂质体是相当稳定的。 基于醚脂的独特结构和四醚脂质体的稳定特性，我们着重评估了 四醚脂质体作为口服载体在疫苗中的作用。结果表明，与普通脂质体 ii 相比，四醚脂质体包裹的卵清蛋白（OVA ）溶液经口服后，BALB/c 小鼠体内不但产生了持久的、更强的系统免疫反应，而且也利于粘膜 免疫反应的产生。而且，四醚脂质体在诱导体外 CD8+ T 细胞增殖反 应方面也有着较普通脂质体超越的能力。为了初步探索脂质体经小鼠 口服后的吸收或分布情况，我们首先借助于荧光标记脂质 （Rhodamine-DHPE ）来考察不同脂质体吸收后的情况，结果表明相 对于普通脂质体，罗丹明标记的四醚脂质体被小肠吸收的总量更高， 而且持续吸收的时间更长。其次我们合成了 Cy5.5-OVA 作为水相的 荧光标记蛋白，并通过小鼠体内成像系统考察不同脂质体口服后的滞 留情况，结果同样表明：相对于普通脂质体，装载 Cy5.5-OVA 的四 醚脂质体被小肠吸收的荧光强度更强，而且在胃肠中能持续更长的时 间。这两个实验中，然而无论是标记的荧光脂质，还是标记的荧光蛋 白，它们的吸收以及持续特性的结果都是一致的。而且，在罗丹明标 记的脂质体吸收实验中，小肠各部位对颗粒吸