刚地弓形虫ntp30基因的克隆与表达及其elisa检测方法的建立.pdf

中文摘要 中文摘要 弓形虫(T0xoplasmagondii)是一种专性细胞内寄生的医学原虫，能感染几乎 所有恒温动物(包括人类)，引起弓形虫病。在免疫功能正常的宿主体内通常形成 包囊，造成隐性感染；但当宿主免疫功能下降时(如肿瘤患者、器官移植者及ADS 患者等)，弓形虫可在宿主体内播散引起弓形虫病甚至导致宿主死亡。弓形虫感染 也是家畜家禽流产、畸胎、死产的主要原因之一，对畜牧业生产危害严重。刚地 弓形虫膜表面蛋白l(SAGl)是弓形虫速殖子期特异性抗原，能够诱导机体产生 面抗原1具有很强的免疫原性，是弓形虫诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。 SAGl抗原在原虫含量较低，因此用基因工程技术在体外表达P30蛋白，然后利用 该蛋白作抗原，建立刚地弓形虫ELISA抗体检测方法。 本实验参考Genb觚k登录的刚地弓形虫(T0xopl嬲ma gondii)P30全基因序列， 片段，然后构建T-A克隆，经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。再亚克隆到原核 于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆，再经PCR扩增和酶切鉴定重组质 免疫学活性，为研究重组蛋白的免疫原性奠定了基础。 P30蛋白经过镍柱纯化后，作为抗原包被聚苯乙烯微量反应板， 重组T．90ndii 优化，结果表明T．gondii 为5％脱脂乳，检测血清稀释度为l：640，抗原和抗体的作用时问为1h，瑚心．兔抗 H2S04为终止液， 猪IgG的最适工作浓度为l：2000，最佳显色时间为15面n，用2M 确定阴阳性的临界值为0．384。包被的重组蛋白均不与猪瘟、猪蓝耳、猪圆环病的 阳性血清发生交叉反应；用此建立的ELISA方法与珥魄方法符合率达90．17％； 表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性和稳定性。本研究建立的间接 ELISA方法，为试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础，并为我国进行猪弓形 虫病的诊断与血清学监测和调查提供了一种技术手段。 关键词：刚地弓形虫，P30基因，克隆表达，间接ELISA． 珏l Abstract 髓e豳ligatei艘鬣ell迸鑫r鲫tozoa鑫pa涮；ite％xoplaSmago鞋麟口．go稚鸯is wOdd谢dc is for andablet0infectall of spread，andresponsibletoxoplasmosis species mammals andbirds．hl hosts are (includmgh啪an) who seVerely AlDS imm撇论compromised(e．g，neopl嬲ticdisease，o坞a旺纽弧spl喇ion，alldpatien哟， of c黼sea攫ss强ina￡ion强d 氇e专乏曲yzoi钯sf。go蟋ii may舶畔贰ly s西seq髓雌 sometiInesbecomefat面．In at the c0瑚【plicatioIlS， addition， veteri芏la巧level， isoneof也em咖cauSeoffetal Ileonatal toxoplaLsmosis