小鼠胚胎干细胞养及神经分化的研究.pdf

摘 要 摘 要 1， 剪刀切割结合针头挤压小鼠胎儿组织能有效获得均匀、大小适中并容易贴壁生 长的小组织块。将这些组织块培养48h，大量的梭形细胞从贴壁小组织块的边 缘游离出的，细胞密度大，细胞生长旺盛，很快形成原代小鼠胎儿成纤维细胞 裂，保持细胞的正常活力。 2． 培养48h时，ES细胞形成边界清晰光滑的克隆，克隆内细胞排列紧密，难以 绿色荧光，RT-PCR检测到细胞有高水平的Oct一4mRNA，碱性磷酸酶AKP反 应结果呈强阳性，表明细胞处于良好的未分化形态。如果在无饲养层培养体系 培养48h，ES细胞出现了不同分化程度的克隆形态，表明饲养层能较好地控 制ES细胞复苏时分化的发生。 3．将在饲养层培养体系中已培养2—3代的ES细胞接种于有饲养层及预铺了0．1 21．8±3．17V8 2．92vs 33．5％vs 6．5％；无饲养层培养：24．7％，27．8％，31．2％vs 0．8％，P(0．01)；但 时，饲养层培养法能显著地地提高ES细胞的AKP阳性度及克隆形成率(2．69 ±0．26vsO．016±0．0005：6．5％vs 的分化抑制中有一定作用，而起主导作用的是外源LIF。 4． 培养液种类及添加谷氨酰胺、丙酮酸钠和非必需氨基酸对Es细胞体外培养的 效果影响较小，而培养用水和血清品质对ES细胞体外培养的效果影响较大。 Milli—Q水经亚沸处理能显著提高Es细胞保持未分化状态的能力，优质胎牛血 清能提高Es的AKP阳性度和克隆形成率。 5． 时，0-56h克隆逐渐变大，变扁平，边缘逐渐不整齐；96h后，在克隆的边缘 VIII 摘 要 出现了向外迁移的、有1．2个突起的圆形或椭圆形细胞，在191h时，细胞可 迁移至克隆边缘的200#m之外，这些有细长突起的细胞表达神经元特异性蛋 白Tau。以后，迁移细胞的突起开始交叠成网状。316h时，细长的纤维可跨越 在不同的克隆之间，长达上千微米。细胞免疫染色检测结果显示，神经分化产 细胞、B—tubulinIII阳性的神经元。对阶段性基因表达的变化观察发现，ES 细胞的特异性转录因子Oct．4开始减弱时，神经干细胞特异性基因Soxl表达 丌始，表明细胞由全能状态进入早期神经分化状态，神经元特异性蛋白Tau 仍可观察到Soxl．GFP绿色荧光的表达，此时的细胞免疫化学染色检测到 III阳性 Nestin阳性、GFAP阳性的细胞及B．tubulinIIIIEt性细胞，以13一tubulin 细胞最为多见，它们呈现出多种形态。结果表明，4-／4+程序及单层分化法都 为ES细胞的神经分化提供了从神经分化起始到神经细胞发生所需的环境，但 于不同发育阶段的神经元。 于低水平状态，培养至122h时，这一比例随着培养的天数的增加而略有增加。 用含LIF的ES细胞完全培养液预培养24h的ES细胞，在后续的神经分化中， 早期神经干细胞特异性基因Soxl、神经元特异性基因Tau的表达时序与胚胎 发育过程相符，分化产生了神经干细胞、神经胶质细胞和神经元，细长的神经 纤维交织成广泛而复杂的网状图像；用含LIF的ES细胞完全培养液预培养72h 的ES细胞，在后续的分化实验中，出现了二种结果：①部分细胞去分化成为 大细胞：②部分细胞进入神经分化，二种分化过程都伴随有细胞死亡增加的现 象。在进入神经分化的细胞中，其分化的进程与预培养24h组相似，但向外迁 移的细胞减少，缺乏广泛的神经纤维联系。结果表明：ES细胞的自发分化程 度将严重地影响其后续的神经分化结果，自发分化程度高的细胞定向分化中会 产生去分化及死亡现象，它们的存在虽然不能完全阻止其周围的自发程度低的 ES细胞起始神经分化，也不改变其