应用基因芯片集系统快速诊断8种猪病病原.pdf

摘 要 摘 要 本实验以严重影响猪生长、健康、繁殖的8种重要的病原为研究对象，构建了能同时、快 速、诊断这8种病原的cDNA芯片检测技术的平台。本实验研究的相关病原有猪日本脑炎病毒 （Japanese encephalitis virus ，JEV ）、猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV) 、口蹄疫 病毒O型和AISA Ⅰ型（Foot-and-Mouth Disease O and AISA Ⅰ，FMDV-O and FMDV- AISA Ⅰ). 、 猪繁殖和呼吸系统综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus ，PRRSV ）、 猪细小病毒 (Porcine parvovirus ，PPV) 、猪圆环病毒- Ⅱ型(Porcine circoviruses- Ⅱ，PCV-2)和 猪瘟病毒（Classical swine fever virus ，CSFV ）。 基因芯片技术是90年代伴随着人类基因组计划的实施而发展起来的一项新技术，它采用 了并行处理和高度集成技术，是一种快速、高效、并行、高通量的基因水平的诊断技术，可 以应用于并行检测数百个疾病相关分子。生物芯片技术在科学研究上的广泛应用，并逐步发 展成为实验室中的常规分子生物学技术，与传统的检测方法相比，有很多优点，如大规模、 高通量、快速检测等。 本研究希望构建一种在基因水平提供处理一次样品就可以鉴别诊断这8 种病原的基因芯 片诊断方法。研究的内容主要包括：选取JEV 、PRV 、PRRSV 、PPV 、PCV-2 、CSFV、FMDV-O 、 FMDV-AISA Ⅰ病原核酸的保守区域，设计8 对特异性引物，对经细胞培养的8 种病原提取的 核酸作为模板，进行PCR 扩增，将8 种病原扩增产物连接到PMDT-18 载体上，构建质粒标 准品，经PCR 扩增质粒标准品并浓缩纯化作为探针，以 0.6µg/µL 的浓度点制于经过氨基修 饰的玻片上；另以经细胞培养的8 种病原提取的核酸作为模板，进行不对称PCR 扩增，所得 产物制备成靶物，并与阳性质控按照10：3 的比例纯化后标记CY3 ，分别与cDNA 芯片探针 置55℃杂交炉过夜杂交，杂交后洗涤，实验数据经Genepix4000A 扫描仪读取。实验结果， 用8 对特异性引物对这8 种病原核酸进行不对称PCR 扩增，所扩增的产物作为靶物均可以特 异地与制备好的cDNA 芯片探针结合，绿色荧光信号清晰可见，背景值均一，即试验中设计 的8 种病原芯片探针可以特异地检测这8 种病原；检测敏感性比普通PCR 高；批内、批间试 验证实应用cDNA 芯片检测这8 种病原具有较好的稳定性。实验结果证明，应用本实验构建 的cDNA 芯片技术检测这8 种病原具有特异性强、敏感性高、稳定性好的特点，为病原检测 方面提供一个新的、可靠性方法，也为疫病的防控和分子流行病学调查奠定了基础。因此， 本研究具有重要的实际意义和应用价值。 关键词 猪病8 种重要病原；cDNA 芯片；探针；不对称PCR 杂交；扫描 I Abstract APPLICATION OF GENE CHIP INTEGRATED SYSTEM TO RAPIDLY DIAGNOSE EIGHT PATHOGENS OF SWINE DISEASES Abstract In this experiment, by taking 8 important pathogens which are affecting the growth, healthy and reproduction in pigs as the research object, a technology based on cDNA microarray assay was established to diagnose