核转录因子-kc-rel亚基克隆及c-relp65p50对猪伪狂犬病毒在bhk21细胞上增殖的影响.pdfVIP

ltlllllll[[[1ll[ttl[IqllltU[[1lllULt[1lltlli 中文摘要 J螋邳璺． factor B)是一种较特殊的转录调节因子，普遍 细胞核因子．船(Nuclearx：appa 存在于真核细胞内，对宿主先天性免疫反应及细胞。增殖、分化和凋亡起到关键的 调节作用。细胞核转录因子一KB可以通过调控相关靶基因的转录与表达，参与机 体的多种生理活动，当机体感染细菌或病毒等致病因素，其信号通路将在一系列 酶的作用下被激活，参与宿主的免疫应答，它的异常活化可能是PRV导致免疫 抑制的重要原因。为获得猪NF．1(B C—Rel亚基序列特性，对PRV感染导致的免 疫抑制与NF—rd3表达异常的关联性进行研究，本试验通过NCBI GeneBank中猪 核转录因子．1(BC．Rel亚基序列(XM C—Rel全序列进行克隆、序列鉴定及生物信息学分析；对PRV感染PK一15细胞 对C—Rel转录时相的影响进行分析；并构建NF—rd3C—Rel真核表达载体，对NF—KB C—Rel亚基真核表达产物对PRV复制的影响进行探讨，结果如下： 1．猪核转录因子NF．KB C．Rel亚基的克隆及序列鉴定本实验采用 C—Rel RT-PCR方法从猪外周血淋巴细胞中扩增到NF．vd3 ORF区并克隆至 vector，克隆获得阳性质粒后测序，进行相关生物信息学分析。 simple pMDl9一T 序列分析结果表明：所扩增猪C．Rel亚基ORF长1773 aa；猪C。Rel bp，编码590 核苷酸序列与不同动物的C—Rel核苷酸序列相似性较高；大部分位于细胞核 (76．0％)内，无信号肽及跨膜区。 2．PRV感染PK．15细胞对NF．KB C．Rel亚基mRNA转录时相的影响分析 本实验成功构建了NF一1(BC．Rel亚基基因的荧定量检测方法；运用此方法对 定并分析。结果表明：标准品拷贝数在一定的浓度范围内有极好的线性关系，相 关系数达到0．998，扩增效率为103．8％；特异性强，扩增产物形成单一的特异性 融解峰；灵敏性高，能检出102copies／ul的标准质粒；重复性好，组内变异系数 h 较小。PK．15感染PRV后，与对照组相比：0～4h，C．Rel转录水平下调，在2 和4h差异显著(P0．05)；4～】2h，C．Rel转录水平快速上调，12h达到转录 11后C—Rel转录水平逐渐下降，24～120h，均维持在较低水 高峰(PO．01)；12 平，其中36h差异极显著(PO．01)，48h，72h和120h差异显著(PO．05)。 万方数据 可见，PRV的感染会导致PK．15细胞中NF．KB活化水平的降低，这与目前的相 关研究结果基本相符。 3．猪NF—KappaB 室已构建的P50，P65真核表达载体两两组合，应用脂质体法转染BHK21细胞， h后接种PRV，应用本实验构建的PRV gE基因荧光定量PCR方法，对细胞上清