牛支原体硫辛酰脱氢酶的蛋白质组学筛选及其功能鉴定.pdfVIP

摘要 摘 要 牛支原体是感染牛的重要致病性病原体之一，可引起包括牛肺炎、乳腺炎、关节炎、角 膜结膜炎在内的多种疾病，且在牛场中较难被彻底消灭。我国自2008年首次报道牛支原体肺 炎至今，该病原已然成为危害我国养牛业的重要因素。目前国内外关于牛支原体的研究主要 集中在病原的免疫及核酸鉴别诊断方面，关于牛支原体蛋白的免疫原性及免疫保护性特征的 研究报道较少。 本研究利用双向电泳(2一DE)技术，完成了牛支原体单个蛋白的分离并结合免疫印迹技术 对其免疫相关蛋白进行了筛选，在本实验室2010年完成牛支原体湖北株的全基因组序列的测 定和注释的基础上，筛选出了LPDH。LPDH是一种黄素氧化还原酶，广泛存在于各种生物中， 并在能量代谢过程中起重要作用。目前，人们己经鉴定了多种生物的LPDH基因，但是还没 有与牛支原体LPDH相关的报道。 本研究利用原核表达系统得到了大小约为68KDa牛支原体LPDH的重组蛋白，并通过条 件优化将原本沉淀表达的蛋白呈现出部分上清表达，从而获取了最大程度类似于天然蛋白的 重组蛋白，纯化后的重组蛋白用彪bovis湖北分离株攻毒牛后获得的阳性血清进行Western blot分析，结果为阴性，但是Dotblot分析，结果为阳性，初步表明该重组蛋白具有免疫原 性，再利用间接ELISA方法对重组蛋白进行免疫学交叉反应实验，发现LPDH重组蛋白与人 工感染和自然获得感染所得的膨bovis阳性血清均能发生特异性反应，进一步证明LPDH重 组蛋白可以作为建立诊断方法的候选抗原。 利用该重组蛋白制备抗牛支原体LPDH的多克隆抗体并对所得抗体进行纯化。我们对牛支 原体不同细胞组分进行提取，并最终利用抗LPDH的抗体通过Westernblot实验证明：在细胞 不同蛋白组分提取物中都存在一个大小约为63Kda的蛋白，而这一结果表明牛支原体LPDH同 时存在于支原体的胞膜与胞浆两个蛋白组分组分中。 目前虽然关于关于牛支原体致病机制仍不是十分清楚，但是大多数学者都认为支原体的 致病一个必不可少的过程是支原体对宿主上皮细胞的粘附过程，牛支原体菌体表面可能存在 与致病相关的脂质相关膜蛋白(LAMPs)，本研究利用激光共聚焦(confocallaser scanning LPDH与牛支原体的粘附细胞过程相关。 综合本研究中所有试验，我们判定牛支原体表面的确存在着LPDH，该酶具有免疫原性； 体外表达该蛋白，发现其Westernblot分析，结果为阴性，但是Dotblot分析，结果为阳性； ELISA实验结果显示该酶可以作为建立诊断方法的候选抗原；利用激光共聚焦技术，可观察 到该酶在牛支原体粘附宿主细胞的过程中确实起～定作用。这些结论为进一步研究牛支原体 粘附机制，致病力以及疫苗研制开辟了新的道路。 关键词牛支原体；双向电泳；Westernblot；激光共聚焦；粘附 东北农业大学农学硕士学位论文 Initial andFunctional Proteom．ics Screening of of Bovis LipoicdehydrogenaseMycoplasma Abstract bovisisan ofinfected cancausea of Mycoplasmaimportantpathogens cattle，which variety bovine andSO diseases，including on．Mycoplasma bovisisdifficulttobeeliminatedincattlefarms．The hasbecomean