牛源化脓隐秘杆的分离鉴定及其pcr检测方法的建立.pdfVIP

摘要 摘 要 化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogene)是一种形态呈杆状的革兰氏阳性菌，在动物机 体免疫力低下时，能够条件性的引起多种动物的化脓性感染，特别是黏膜组织感染：继而继 发多种疾病，如奶牛乳房炎、牛子宫炎、肾脓肿感染、肝脓肿、火鸡骨髓炎、母猪子宫内膜 炎、仔猪关节炎和猪肺炎、以及多种动物急性呼吸道感染症等。畜禽条件性感染化脓隐秘杆 菌造成的生产性能下降、机体抵抗力减弱等对养殖业的持续健康发展造成一定危害。本文以 致规模化牛场犊牛上呼吸道急性感染的病原检测为出发点，从病死犊牛肺脏等呼吸器官组织 中分离出2株细菌。对分离菌进行常规细菌学鉴定(形态特征、染色特性、培养特性及生化 特性等)和Biolog自动快速微生物鉴定系统鉴定，结合16SrRNA分析确定分离菌为化脓隐 秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)。小鼠致病性试验显示纯培养物对小鼠致死率较高，药敏 试验表明分离菌仅对少数种类抗生素如头孢唑啉、氧氟沙星等敏感，为临床用药提供了参考。 为快速诊断化脓隐秘杆菌感染，建立了检测溶血素(PLO)基因的快速PCR方法，敏感 性试验显示最低检出菌数为9,2×103CFU／mL，特异性试验表明与其他细菌如布鲁氏菌、大肠 杆菌等无交叉反应。重复性试验显示此方法具有良好的重复性和稳定性。在临床检查中，PCR 检测与传统生化鉴定一致。 为研究化脓隐秘杆菌的致病力，本课题相继克隆了该菌的3个毒力因子溶血素(pyolysin， PLO)、胶原结合蛋白(Collagen—Binding 的基因，参考Genl3ank已经发表的基因序列，设计了7对引物，通过PCR分别克隆化脓隐 秘杆菌的plo、ebpA、nanH基因，通过序列测定，研究了其与参考毒株的同源性。结果表明： 克隆的plo基因核苷酸序列与GenBank中收录的化脓隐秘杆菌的基因的同源性在98％以上， 85％以上，种系进化树分析结果进一步表明了其与化脓隐秘杆菌属进化结果一致。该菌3个 毒力因子的克隆，为在基因水平上探讨细菌毒力因子与细菌致病力的关系提供了物质材料， 为分离菌致病性相关研究奠定了基础。 本研究成功分离和鉴定了2株化脓隐秘杆菌，数次药敏试验为临床用药提供了依据；分 离菌主要毒力因子的克隆和序列分析，为研究毒力因子与细菌致病力的关系提供了基础材料。 并在研究毒力因子溶血素的基础上，建立了一种特异、敏感的PCR方法，为化脓隐秘杆菌的 实验室检测提供了一种快速、准确的方法。 关键词：牛：化脓隐秘杆菌；分离鉴定；PCR检测方法；毒力因子 Abstract … —J● ●J一● ^ lsolationandldentiticationot Arcanobacteriumandthe pyogenes ofthePCRBasedDetective Development Method Abstract Arcanobacterium cause bacterium，often pyogenes，aGram-positive，nonmotile，rod-shaped infection undertheconditionofthelow and purulent opportunistically,especially immunity in of