猪3种繁殖障碍病毒多重pcr监测方法的建立.pdfVIP

Anhui Agricultural University Master Dissertation The establishment of a multiplex PCR for detecting three reproductive failure virus of porcine Candidate ： Cheng Liang-liang Supervisor： Zhu Liang-qiang Academic Degree applied for ： Master of Agriculture Major ： Basic Veterinary Science Direction ： Animal Pathology and Biological Prevention College ： College of Animal Science and Technology June 20 13 II 中文摘要 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪伪狂犬病(PR)是影响养猪业发展的两种重要的 传染病，而引起这两种疾病的病原就是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、高致病性 猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及猪伪狂犬病病毒(PRV) 。这三种病毒均是引起 猪繁殖障碍性疾病的重要病原体，且在临床上多发生混合感染，虽然运用常规的病原 学和血清学诊断方法也可区分此类症状相似的疾病，但这些常规方法却存在操作繁 杂，耗时长，敏感性低等不足，难以用于混合感染时两种疫病的早期快速诊断。许多 学者相继建立了检测 PRRSV 、HP-PRRSV 和 PRV 的PCR 技术，但同时鉴别检测这 3 种病毒的多重 PCR 方法还未见报道。因而，本试验建立了一种能够快速、准确、有 效的检测 PRRSV 、HP-PRRSV 和 PRV 的多重PCR 方法，并应用该方法对送检的 120 份临床病料进行了检测。 1 PRRSV、HP-PRRSV 和 PRV 多重 PCR 方法的建立 根据GenBank 中登录的PRRSV 、HP-PRRSV 的Nsp2 基因缺失区序列信息及PRV 的gB 基因保守区序列，利用 Primer Premier 5.0 和 DNAStar 软件分别设计并合成了 2 对特异性扩增引物，扩增目的片段长度分别为 319bp、232bp 、383bp 。在成功建立单 项 PCR 的基础上，通过对模板浓度、酶浓度及引物混合液浓度等条件的优化，先进 行了 HP-PRRSV 和 PRV 双重 PCR 的建立；而后在双重 PCR 的基础上，通过调整 PRRSV 模板的添加量和同时扩增 PRRSV 、HP-PRRSV 的引物混合液用量，最终建立 起能够同时鉴别检测 PRRSV 、HP-PRRSV 和 PRV 的多重 PCR 诊断方法。该方法具 有良好的特异性，敏感性试验表明，该方法能检测出 3 种病毒的最低模板量分别约为 2.48ng、2.22 ng 和 0.44 ng 。 2 PRRSV 、HP-PRRSV 和 PRV 多重 PCR 方法的初步应用 利用已建立的 PRRSV、HP-PRRSV 和 PRV 多重 PCR 方法对安徽省部分地区送 检的 120 份临床病料进行了检测，结果显示，检出 PRRSV 阳性样品23 份，HP-PRRSV 阳性样品 71 份，PRV 阳性样品40 份，总阳性检出率分别为 19.2%、59.2%、33.3% 。 其中，混合感染 PRRSV 和 HP-PRRSV 的样品有 8 份，占总数的6.7%；混合感染 HP-PRRSV 和 PRV 的样品22 份，占总数的18.3%；混合感染 PRRSV 、HP-PRRSV 和 PRV 的样品 15 份，占总数的12.5%。由此说明，送检病料中以 HP-PRRSV 感染为 主，且发生混合感染。 以上研究表明，本试验建立的多重 PCR 方法具有快速、特异、敏感的特