猪圆环病毒2型rf2基因的原核表达及其单克隆抗体的制备和鉴定.pdfVIP

摘 要 摘 要 猪圆环病毒（Porcine circovirus ，PCV）为圆环病毒科，圆环病毒属成员，分为PCV1 和 PCV2 两个血清型。PCV1 不引起猪发病；但是PCV2 不仅是原发性断奶仔猪多系统衰竭综合 征（PWMS ）的主要病原，还与许多疾病密切相关。PCV2 能在猪单核巨噬细胞中增殖，造 成免疫细胞数量减少和对病原缺乏有效的免疫应答能力。建立对该病原和感染血清抗体检测 对有效防治本病具有重要意义。 本研究采用PCR方法扩增了去除核定位信号序列的PCV2 ORF2基因片断约576bp ，将所 得片断与表达载体pPRO-HTb进行连接，连接产物转化到感受态细胞BL21中，经IPTG诱导， 重组菌经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）检测初步证明PCV2 Cap蛋白获得了表达，产物 分子量约为27ku ，Western-Blot 分析，所表达的蛋白能与PCV2 阳性抗血清发生特异性反应， 说明重组蛋白具有良好的反应原性，为以重组蛋白为检测抗原建立PCV2血清抗体检测方法奠 定了基础。 重组蛋白经纯化和复性免疫BALB/c 小鼠，按常规方法取SP2/0 骨髓瘤细胞和免疫小鼠 脾细胞融合，制备了杂交瘤细胞，通过有限稀释经３～4 次筛选、克隆，获得了 3株稳定分 泌抗体的抗PCV2-Cap蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，3株单抗分别命名为1C2，3C11和3E11。 其细胞培养上清抗体效价分别为 1:l600、1:12800 和 1:l600；3株单抗的 Ig亚类均为 IgM； Western-blot 分析、Dot-ELISA和间接免疫荧光结果显示1C2，3C11和3E11均能与PCV2病毒 发生反应，而不与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪细小病毒等引起繁殖 障碍、猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒等病毒发生反应，表明这3株单抗具有高度特 异性。抗PCV2单克隆抗体的制备，为建立准确、快速的PCV2 病原检测提供了基础。 关键词 猪圆环病毒；PCV2-ORF2融合蛋白；单克隆抗体 I Abstract Expression Of PCV2-ORF2 In Prokaryotic Cells And Its Preparation And Identification Of Monoclonal Antibodies Against Cap Protein Of PCV2 Abstract Porcine circovirus (PCV) was divided into the family porcine circovirus, genus porcine circovirus, which included two serotypes of PCV1 and PCV2. PCV1 had no pathogenicity of swine, but PCV2 was main pathogen of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) and was closely related to many diseases. PCV2 can in propagate in the hugely bite the cell, and appeared Immature granulocytes of low density, which can reduce the quantity of the immunity cells, lacking the valid immunity answer ability. The method establishing of PCV2 pathogen and infection serum antibody had very important significance for preventing PCV. In this study, we used PCR method to am