猪圆环病毒or2基因和细小病毒vp2基因真核表达载体的构建及鉴定.pdfVIP

摘 要 猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine Circovirus Type2, PCV-2)是引起断奶仔猪多系统衰竭 综合征、母猪繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征和呼吸道综合征等相关疾病的重要病原。 PCV-2 主要损害猪的免疫功能，造成免疫系统全面衰竭，进而继发感染其他疾病， 给养猪业带来巨大的损失。猪细小病毒（Porcine Parvovirus, PPV)作为猪繁殖障碍的 主要病原体之一，主要引起怀孕母猪流产、死产及胎儿木乃伊化，国内外相继报道 猪圆环病毒和猪细小病毒混合感染的病例，使养猪业面临着严峻的挑战。 本研究在PK-15 细胞上增殖猪圆环病毒Ⅱ型分离株(PCV-2)和猪细小病毒7909 株(PPV)，收获的细胞毒采用蛋白酶K 法提取两种病毒的全病毒核酸。利用primer5.0 软件自行设计了两对特异性引物并扩增出ORF2 和VP2 的全基因。然后选取Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅴ三个酶切，将两段目的基因分别连接到pCDNA3.1(+)真核表 达载体 , 构建了三种重组质粒 pCDNA3.1-ORF2 、pCDNA3.1-VP2 和 pCDNA3.1-ORF2-VP2 ，通过酶切，10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明：ORF2 和VP2 正确的插入到载体中。 采用碱裂解法和聚乙二醇沉淀法大量提取三种重组质粒，利用紫外分光光度计 分析质粒浓度及纯度，结果显示：重组质粒浓度较高，并且没有蛋白污染。对试验 小鼠左后肢股四头肌进行盐酸普鲁卡因药物预处理，预处理24h 后，同样的部位进 行重组质粒肌肉注射，免疫剂量为0.2mg/只，共免疫三次；每次间隔两周；二免后 一周和三免后一周，采用摘除眼球方法收集血液分离抗体，间接ELISA 方法测定抗 体水平，结果显示：三种重组质粒均能诱导小鼠产生抗PCV-2 和PPV 的抗体，第 三次免疫抗体水平较高，为研制抗PCV-2 和PPV 核酸疫苗提供了科学依据。 体外表达试验将重组质粒通过Lipofect Transfection Reagent 试剂盒转染PK-15 细胞，转染48h 后收获细胞，运用Trizol 法提取细胞总RNA ，RT-PCR 检测目的基 因的转录情况；转染细胞筛选2 周后，收获阳性克隆，Western-blotting 检测体外蛋 白表达情况。RT-PCR 检测结果表明，目的基因整合到了细胞的染色体上，并且能 够转录到 RNA 水平；Western-blotting 检测结果表明，目的基因能够在体外进行表 达，NC 膜上得到了Cap 蛋白和VP2 结构蛋白两条特异性条带，大小分别为28kDa 和64kDa，与预期的结果相符，为激发猪对圆环病毒与猪细小病毒进行体液免疫及 细胞免疫的多价抗原的研制奠定基础。 关键词： ORF2 基因；VP2 基因；真核表达质粒；体内外试验；鉴定 Construction and Identification the Eukaryotic Expression Vector of Porcine Circovirus Type2 ORF2 Gene and Porcine Parvovirus VP2 Gene Author: Kang Yanan Supervisor: Prof. Yang Runde Specialty: Preventive Veterinary Medicine Abstract Porcine Circovirus Type2 is the primary causative agent of Post-weaning multisys- temic wasting syndrome,Sow abortion and mortality syndrome,Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,and so on.PCV-2 could