猪瘟兔化弱毒s传代细胞源疫苗效检替代方法和猪瘟病毒鉴别检测方法的建立.pdfVIP

摘要 swine swinefevervirus，CSFV)引起的 猪瘟(classicalfever，CSF)是由猪瘟病毒(classical 高度接触性、多系统出血性猪传染病。我国对于猪瘟的防控主要以猪瘟兔化弱毒疫苗大规模免疫 为主。但是点状散发的猪瘟疫情仍时有发生，并且在我国分布广泛，流行态势日趋复杂。 在这种情况下需要对疫苗免疫和野毒感染动物进行鉴别检测，调查猪场巾猪瘟隐性感染或持 续性感染的情况，同时通过一定的方法提高猪瘟兔化弱毒疫苗的质量。术研究旨在建立猪瘟兔化 弱毒ST传代细胞源疫苗的效检替代方法以及对猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒和牛病毒性腹泻病毒的 鉴别检测方法，为我国猪瘟的防控工作提供帮助。(1)以兔体定型热法进行猪瘟疫苗效检受试验 兔个体差异和饲养环境的影响很人。本研究将待检疫苗系列稀释后接种易感细胞，使用 能够检测到的阳性稀释度的高低可以反映疫苗中的有感染性病毒粒子的浓度，以最高阳性稀释度 作为疫苗效价的指标。使用该方法对12批猪瘟兔化弱毒ST传代细胞源疫苗和3批猪瘟兔化弱毒 牛睾丸疫苗进行效检并与兔体定型热法效检的结果进行比对。结果表明，ST传代细胞源疫苗的 RID。牛睾丸疫苗的阳性稀释度!lO’4，每 阳性稀释度达到IO～～IO～，每头份含2．6×104～3．O×104 RID，本方法效检的结果与兔体定型热法存在一定的相关性，并且能够 头份含7．0×103～8．O×103 反映疫苗中有感染性病毒粒子的多少。(2)在猪瘟兔化弱毒基因组3’端12nt多聚T碱基插入区 域两侧的保守区域内分别设计一对外围引物和一对内丽引物。猪瘟兔化弱毒的扩增片段因包含有 多聚T碱基插入片段所以要长于猪瘟野毒的扩增片段。RT-nestPCR方法对于猪瘟兔化弱毒C株 和猪瘟石门毒的检测极限分别为0．032pg和0．045pg病毒RNA。特异性试验的检测结果显示，该 方法能够有效检测各类型的猪瘟病毒，对非猪瘟的其它病原的检测结果均为阴性。对400份健康 猪扁桃体临床样本进行检测得到4份猪瘟兔化弱毒和12份猪瘟野毒阳性样本。对14批猪瘟兔化 弱毒疫苗的检测表明所有疫苗均可检测到猪瘟兔化弱毒并且未发现存在猪瘟野毒污染。所建立的 RT-nestPCR鉴别检测方法能够有效区分猪瘟兔化弱毒和猪瘟野毒，特异性好、灵敏度高。(3)通 过对47条猪瘟病毒、7条牛病毒性腹泻病毒和3条边界病毒基因组全序列比对，分别在猪瘟兔化 弱毒、猪瘟野毒和BVDV基因组保守区域设计了3条TaqMan．MGB探针和配套引物。采用正交 试验设计对上、下游引物浓度、探针浓度以及退火温度进行优化。特异性试验表明该方法在同时 鉴别检测猪瘟兔化弱毒、不同基因型的猪瘟野毒和BVDV时均能在相应荧光通道观察到特异性扩 增曲线，各通道间无荧光干扰，对其它病毒的检测则无扩增曲线。重复性试验结果显示组间和组 内变异系数均不大于1％。敏感性试验表明该方法对猪瘟兔化弱毒、猪瘟野毒Shimen株、 4 、1 BVDV 株的检测极限分别为31．拷 5．8拷贝mL、32．5拷贝。对400 nogerO_贝．／rtL组床临／laL份 织样本检测得到4份猪瘟兔化弱毒阳性、12份猪瘟野毒阳性、22份BVDV阳性，对14批商品化 猪瘟兔化弱毒疫苗的检测表明均能检测到猪瘟兔化弱毒，并且无猪瘟野毒和BVDV污染，与其它 检测方法的符合率达到95％以