猪繁殖与呼吸综征病毒2b蛋白稳定表达细胞株的建立.pdfVIP

摘 要 目的：建立2b蛋白稳定表达的细胞株。 方法：提取PRRSV CC-1 扩增条件扩增成功后，凝胶电泳并回收目的片段。将该片段与pMDl8．T克隆载体相 连。转化至大肠杆菌DH50感受态细胞。筛选转化成功的阳性克隆菌。提取质粒，并 进行PCR和单双酶切鉴定。鉴定成功后送至测序。构建2b蛋白基因的原核表达载体 蛋白电泳SDS．PAGE鉴定正确后，运用Ni2+亲和层析法在自然条件下纯化重组蛋白， 鉴定完成后，大量提取质粒，通过脂质体介导的转染方法，将重组质粒转染Marc-145 细胞，在荧光倒置显微镜下观察。转染后进行细胞株筛选，进行目的基因转录、 Western．Blot。 结果： 1、成功克隆了PRRSV 2b蛋白目的基因。该片段碱基序列为222bp，编码73个 氨基酸。 的蛋白大小为17KD，成功制备多克隆抗体。Western．Blot鉴定大小与预期一致。 细胞株 合形成通道，PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂 奠定基础。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征；2b蛋白；表达；细胞株 EstablishmentofCellLinesto ofPorcine StablyExpressing and Virus2bProtein ReproductiveRespiratorySyndrome Abstract to ofCellLines Stably Objectiv：Establishment Expressing． of Methods：ExtractionPRRSVCC．1straintotal RNA，landed toits PRRSVCC-1strainofthenucleotide and Oli906 published sequence，usingprimer5 softwareto a of of2b．Itissuccessfulfor the designcouplespecificprimers amplificating for and the conditionsof fragment recyclingfragment．Juncted PCR,gelelectrophoresis E．coli and 18-T vectorandtransformedinto DH5acompetencecell．Screening pMDcloning the the cloneswhichweretransformed Thenextracted DNA， positive