猪瘟病毒疫苗c体外适应性的分子基础研究.pdfVIP

摘要 swine 猪瘟(Classicalfever,CSF)是严重危害养猪业的传染病之一，具有高 传染性和高致病性的特点。其病原为猪瘟病毒(CSFV)，属黄病毒科瘟病毒属成 员。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长约12．3kb。猪瘟病毒在体 外细胞系中的增殖只局限于少数猪肾和睾丸细胞。虽然疫苗C株是唯一能在兔 体内复制增殖的猪瘟病毒，但它在体外培养细胞中的增殖水平比较低。该特点不 仅阻碍了对其弱毒机制研究和新型弱毒标记疫苗的研制，而且也在一定程度上影 响了疫苗生产成本。已有研究结果表明，猪瘟病毒在细胞内的增殖可能受多个环 节的调控，而疫苗C株在体外适应性的分子基础以及影响C株在细胞中低水平 增殖的机制并不清楚。本研究目的是：(1)鉴定与C株传代病毒体外增殖特性 相关的差异位点；(2)解析这些位点对C株病毒在细胞内增殖的影响。 1、猪瘟病毒疫苗C株持续感染细胞模型的建立 以本实验室构建的猪瘟病毒疫苗C株感染性克隆pA．RecC为模板，体外转录 RNA并电转于猪肾传代细胞系PK-15中。经连续传代110代，成功建立了稳定的 病毒持续感染细胞模型，获得RecC．PKl5细胞株。用间接免疫荧光法(IFA)检 测RecC．PKl5细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况。结果表明，在传代细 胞中均有CSFV存在，并从第十代开始能检测到子代感染性病毒粒子，表现出病 毒持续感染的基本特征。 2、高、低代孜C株传代病毒体外适应性差异及全基因组序列务析 10四个代次病毒在 通过比较RecC．p40、RecC．p60、RecC—p80和RecC—pl PK．15和ST细胞中的生长特性，发现高代次传代病毒的细胞适应能力明显高于 低代次病毒，并且它们在ST细胞中的增殖效率明显高于在PK一15细胞中。IFA 检测结果同样表明，在感染病毒48、72和96小时后，无论是在PK-15或ST细 胞中，高代次传代病毒的荧光斑数量都明显多于低代次传代病毒。对RecC-p40、 非编码区，1个位于NS4B非结构蛋白中。 3、差异位点对C株病毒体外适应性影响务析 为进一步研究C株病毒体外细胞适应性的分子机制，构建并拯救了5株携带 上述核苷酸单一突变的重组病毒，并应用IFA、Real-timePCR和病毒感染滴度 (TCID50)测定技术，分别从病毒抗原、病毒基因组RNA复制水平和病毒感染滴度 变化三个方面，以RecC．p80传代病毒为对照，对它们的体外生长特性进行了比较。 结果显示，5株病毒的荧光斑数量基本无差异，RNA复制能力基本一致。但病毒 滴度结果表明，T3310G突变株与对照株能检测到的子代感染性病毒粒子量明显 多于其余突变株。以上结果说明T3310G突变位点有可能是影响病毒组装、释放 过程的关键位点。 上述试验结果为深入开展CSFV疫苗C株体外适应性分子机制的研究和新型 高效疫苗开发奠定了良好基础。 关键词：猪瘟病毒疫苗C株，感染性克隆，生长特性，细胞适应性 n Abstract diseaseof swine a andoftenfatal Classical contagious fever(CSF)ishighly lossestotheswine swineandwild economic industry．The boar,causingsignificant the diseaseisclassicalswinefever memberof causativeof