猪繁殖与呼吸综征(prrs)和伪狂犬病elisa抗体检测方法及prrsv弱毒活疫苗研究.pdf

中文摘要 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine and ReproductiveRespiratory Virus，PRRSV) 伪狂犬病(Pseudorabies，Pr)分别由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS 和伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起以母猪繁殖障碍和仔猪死亡为主要特 征的病毒性疾病，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。为使PRRS和Pr能得到及 时准确地诊断，也为PRRS的预防提供安全有效的疫苗，从而达到更有效地控制疾病 的目的，因此，进行本研究，研究内容如下： 1．兔抗猪IgG的酶标记 用纯化的猪IgG免疫家兔获得高效价兔抗猪IgG，采用过碘酸钠氧化法，用辣根 过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG，制备出有高免疫学活性和高催化活性的兔抗猪 病的ELISA诊断方法建立奠定了基础。 2．酶联免疫吸附试验(ELlsA)检测猪伪狂犬病血清抗体 与进口试剂盒比较检测和初步应用结果表明：建立的间接ELISA具有敏感性高、特 异性强、重复性好的优点，可用于猪伪狂犬病血清抗体的定性和定量检测。用建立的 月，临床应用也取得了满意的效果，这为猪伪狂犬病的诊断提供了一种敏感性高、特 异性强且可用于大规模血清学检测的方法。 3．猪繁殖与呼吸综合征病毒膜基质蛋白基因和核衣壳蛋白基因的克隆和原核表达 ATCC VR一2332株核苷酸序列同源性分别为100％和99％，与欧洲型PRRSVLV株核 一步证实PRRSV克隆20株属于美洲型毒株。 (Glutathione 可用作血清学检测方法的靶抗原。 中文摘要 SDS—PAGE和Western—blot检测证明：串连的ORF7、ORF6 达质粒pGEX—KGNM， 且具有免疫学反应活性，也适合用于建立PRRS血清学诊断方法。 4．检测PRRSV血清抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法的建立 在原核表达的基础上，通过方阵滴定，用提取的重组N蛋白(rN)和重组NM蛋 血清最适稀释度均为l：40，阴阳性判定的临界值为O．4，都表现出较好的敏感性、特 异性和重复性，但检测PRRSV抗体rNM—ELISA的建立在国内外属首次。 将建立的rN．ELISA和rNM．ELISA分别与IDEXXELISA试剂盒进行比较检测 IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒的方法。在蛋白稳定剂作用下，所制备的PRRSV抗体检测 供了一种特异敏感、安全不散毒、保存期较长且适合我国国情的血清学诊断方法。 5．猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗研究 的NCS，用0．25％胰蛋白酶与0．02％EDTA以4：1混合配制的细胞消化液消化细胞， 10-6．55／0．1mL的高滴度PRRSV溶液，为生产疫苗打下基础。 激猪产生特异性抗体应答，接种后14d可检测出特异性中和抗体。疫苗内的PRRSV 滴度在冻于前后变化不大，冻干疫苗在4—8℃保存时有效期为6个月，．20℃保存时有 效期为18个月，表明生产的PRRSY弱毒活疫苗对猪安全、有较好的免疫原性，可 用于PRRS的预防接种。 酶联免疫吸附试验(ELISA)，膜基质蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋 白)，基因克隆，原核表达，疫苗。 2 Abstract Porcine and syndrome(PRRS)and reproductiverespiratory are in characterized failureSOWSanddeathin caused b