猪胸膜肺炎放线菌apxⅳn端基因的原核表达及乳胶凝集方法的建立.pdfVIP

摘 要 猪传染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的一种高度传染性、 致死性猪呼吸道疾病, 以急性出血和慢性纤维素性胸膜肺炎病变为主要特征，自 1957 年 Pattison 等首次报道以来已在世界各地广泛流行。本研究是以新疆石河子周边地区 几个规模化养猪场为研究对象，通过血清流行病学调查、细菌的分离鉴定以及在此基础 上初步建立检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素抗体的乳胶凝集方法，为猪传染性胸膜 肺炎的快速诊断提供了技术支撑。 1.本研究采用ELISA检测方法对新疆石河子周边地区几个规模化养猪场进行猪胸膜 肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素抗体的检测。检测结果显示，猪场PCP 总抗体阳性率为61%， 各年龄段猪抗体阳性率为：哺乳仔猪27.6%；保育猪64.3%；育肥猪56.5%；母猪76.5%； 表明猪群中普遍存在APP 感染。 2. 从石河子周边规模化养猪场病死猪扁桃体、肺脏组织中利用含 1%V 因子脑心浸 液琼脂培养基分离得到1 株细菌，通过菌体形态、染色特性、培养特性、生化特性、对 生长因子的需要以及ApxIV 基因的PCR 快速检测，鉴定该分离株为生物I 型即NAD 依赖 性猪胸膜肺炎放线杆菌，编号为2009JH 株。 3.参照GenBank 上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV 基因序列(AF021919)从临床分 离株中扩增猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIVN 端ApxⅣ2.5 基因片段，应用软件对序列进行分 析,预测可能存在的抗原表位。PCR 扩增包含预测抗原表位的ApxIV1 （447bp-1949bp）、 ApxIV2 （1497bp-2873bp）、ApxIV3 （1497bp-1949bp）3 个片段，将其克隆到 pMD19-T 载体中经酶切鉴定后构建原核表达载体，将重组表达质粒转入 E.coli BL21，经 IPTG 诱导表达，进行SDS电泳分析及Western blot 检测。结果显示三个重组质粒诱导 表达出蛋白分子量大小为55kDa、50kDa、20kDa。Western blot 检测显示除20k 大小的 蛋白无特异性条带外，其余有很好的反应原性。 4.采用Ni-NTA His.Bind 方法纯化pET-28a- ApxIV2 表达蛋白，以羧化乳胶为载体， 经化学交联的方法致敏乳胶，对致敏乳胶试剂进行自凝性、特异性、重复性、敏感性、 对比试验。结果表明，在pH 4.7 的PBS 缓冲液中，乳胶浓度为2%、蛋白浓度为1.5mg/ml 偶联8 小时后制备的致敏乳胶凝集反应最好，致敏乳胶抗原无自凝现象；与副猪嗜血杆 菌、猪瘟、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征阳性血清不发生凝集；批内重复、批间重复 试验很稳定；阳性血清敏感性可达 1：32。对比试验中与ELISA 方法的符合率为80%， 两种方法检测的结果基本相符。表明建立的ApxⅣ乳胶凝集检测方法具有良好的特异性、 稳定性和敏感性，初步建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素抗体的乳胶凝集方法， 为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断提供了技术支撑。 关键词：血清学调查；分离鉴定；ApxⅣ毒素；乳胶凝集试验 I Abstract The Pleuropneumonia caused by Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) is one of the highcontagious and causing death bacterial deseases of the swine respiratory tract, The disease was charanterized by chronicity fibrinous and acute hemorrhagic,occurring widely around the world by Pattison first reported in 1957.The surveys on APP were from several