猪腮腺分泌蛋白达特性及表达调控元件的研究.pdf

摘要 哺乳动物唾液腺是外分泌腺，也兼有部分内分泌功能。大多数分泌物可通过口腔直接到达胃 部，在pH)4的情况F发挥作用{少量分泌物可直接进入血液循环发挥作用。唾液蛋白种类繁多， 功能多样，往往一种蛋白有数种功能，不同蛋白有相同功能。唾液蛋白的上述特点使其具备了研 制生物反应器的条件。 腮腺分泌蛋白(ParotidSecretoryProtein，PSP)就是一种腮腺特异性表达的蛋白，由于它的功 Chain Polymerase quantitative 的表达情况进行了研究。结果表明，猪与小鼠的PSP在腮腺生后发育的各时期都是高效表达的， 而且PSP的表达量随发育甥呈动态变化；并且与AMY的变化方向一致，推测二者存在协同性表 对猪PSP的全长氨基酸序列进行了抗原决定簇分析，推测猪PSP有4个抗原决定簇，分别位 肽与匙孔血蓝蛋白连接，免疫家兔，获得了抗猪PSP抗血清。从蟹白质水平对其表达情况进行了 研究。在整个研究过程中，将a一唾液淀粉酶及三磷酸甘油醛脱氢酶的表达情况作为对照。研究 发现PSP在猪及小鼠中都是腮腺特异性高效表达，表达量在不同发育期呈动态变化，且始终高于 6APDH。并且在6周龄小鼠腮腺中发现了一个20KDa的蛋白，能与PSP抗体发生反应。 在第二部分中，首先利用RLM一5’RACE进行了猪PSP转录起始位点的定位，结果表明，通过 的开放阅读框(0penReading 游22个碱基处(ATG矗!酆)。而猪PSP基因的转录起始位点，位于该基因新的ORF起始密码子上 游lg个碱基处。在随后进行的PSP核心启动子预测中，分析发现猪PSI)基因的启动子属于非典 型启动子，不具有TATA box等经典元件；但有8个IIlr在转录起始点附近，而且其中两个IⅢ 刚好覆盖在转录起始位点上，这佐证了5’RACE结果，并且与lnr本身的特点也有很好的符合。 随后用瞬时转染法对功能性启动子进行定位。首先成功地将普通转染载体改造为启动子分析 专用载体。利用一系列嵌套引物对启动子区片段进行了扩增、克隆、亚克隆，成功构建了含有不 同长度5’调控区的细胞转染载体。我们利用人唾液腺癌细胞系(Acc—M)作为转染平台。我们培养 了猪腮腺原代上皮细胞，将其作为Acc-M的对照和补充。我们拟用质脂体转染法将外源基因导入 哺乳动物细胞，为此，我们对不同培养基配方进行摸索，确定了最佳的转染条件。 关键词：腮腺分泌蛋白，唾液淀粉酶，转蒙起始点，细胞转染，载体构建，启动子，核心启动子 定位，表达特性，定量分析 ABSTRACT to secretion have function Mammalian external salivaryglandsbelong glands，butthey part the workin ofendocrine secretionscanreachmouth glands．Most by salivarypenaltube，and stomachwhen afractionofsecretionscanreach intothebloodstream．There pH4．Whjle directly secreted whicha have andseveral arelotsofsalivary proteins，in proteinmay mphlfunction samefunction．Somammalian canbeusedasbioreactors． sharethe salivarygland proteinsalways