猪脑心肌炎病毒结构蛋白2c的原核表达与间接elisa方法的建立.pdfVIP

摘 要 猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis viurs ，EMCV ）引起猪的 以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要特征的急性传染病。本研究针对 EMCV 非结 构蛋白2C 基因设计合成了一对特异性引物，通过RT-PCR 获得了长为 1062 bp 的 2C 基因序列，构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-2C ，并在大肠杆菌BL21 细胞中 成功表达了62 ku 预期大小的重组2C 蛋白，蛋白表达量约为33.9 ％。重组2C 蛋白 于室温保存72 h ，-20℃和-80℃分别保存12 月，冻融9 次未见降解。Western blot 分析表明，重组2C 蛋白可以被猪源或兔源抗EMCV 阳性血清识别。 以纯化的重组2C 蛋白作为包被抗原建立了检测EMCV 抗体的间接ELISA 方 法，确定了方法的最佳工作条件和阴阳性临界值，检测了方法的特异性、敏感性、 重复性，并用该方法分析了EMCV 感染动物2C 抗体的产生动态。试验结果表明， 间接ELISA 的阴阳性临界值为0.27 ，以1 µg/mL 的重组2C 蛋白于37℃包被1 h 后 4 ℃过夜，用含5 ％小牛血清的PBST 于37℃封闭1 h，待检血清作1׃20 倍、酶标二 抗作1׃400 倍稀释后分别于37℃反应1 h 和45 min 后，加底物后于室温避光显色15 min 为最佳工作浓度和工作条件。重组 2C 抗原与猪抗 CSFV、PCV2 、PPV 、PRV 和PRRSV 等5 种阳性血清不发生交叉反应，EMCV 可以阻断重组抗原与脑心肌炎 阳性血清的特异性反应。该ELISA 方法与血清中和试验的符合率为95.7 ％（22/23 ）， 相对敏感性为 90.9 ％（10/11）；同一时间批内重复性试验的变异系数＜10％，不同 时间批间重复性试验的变异系数＜15％。应用该方法可以在EMCV 感染仔猪后4 d ， 检测到相应抗体，感染后7 d 抗体水平最高，随后逐渐下降，直至感染后21 d 仍然 可以检测到较低水平的2C 抗体。 应用建立的间接ELISA 方法检测了2006~2008 年间河北省不同地区31 个规模 化猪场的1306 份血清样本。结果显示，EMCV 抗体阳性率平均为13.48％，其中经 产母猪的抗体阳性率最高（27.68 ％），其次为后备母猪和哺乳仔猪（分别为 16.67 ％和2.86 ％），育成猪EMCV 抗体阳性率最低（1.98％）。 上述研究结果表明，重组EMCV 2C 蛋白具有良好的稳定性和反应原性；以其 作为包被抗原，建立的间接ELISA 方法可以用于猪脑心肌炎的早期诊断和血清流行 病学调查；河北省猪群中存在EMCV 感染现象，尤以经产母猪的感染率最高。 关键词：EMCV ；2C 基因；克隆；原核表达；ELISA ；血清学调查 Abstract Pocrine encephalomyocarditis is an acute infectious disease of swine caused by encephalomyocarditis virus （EMCV ）and characterized by encephalitis, myocarditis or inflammation around cardiac muscles. In this study, first, a pair of specific primer to EMCV nonstructural protein 2C gene was designed and synthesized and 2C gene sequence of 1062 bp was obtained by RT-PCR. Moreover, recombinant expression plasmid pGEX-6P-2C was constructed and predicted recombinant nonstructural