金黄色葡萄球菌护性抗原基因重组牛痘病毒的构建与鉴定研究.pdfVIP

金黄色葡萄球菌保护性抗原基因重组牛痘病毒的构建与鉴定研究 摘 要 金黄色葡萄球菌是一种能感染多种动物的常见革兰氏阳性球菌。病原学调查 表明，金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原之一，对奶牛养殖业的危害 较重。为了有效预防奶牛乳房炎的发生，目前迫切需要研究有效的金黄色葡萄球 菌疫苗。为此，本项目开展了以下研究工作： 1、致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌SHZ1 株保护性抗原基因的克隆与序列 分析：利用PCR 技术从致奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌 SHZ1 株基因组中扩增 出FnBP 基因和ClfA 基因，克隆至T 载体并进行测序。结果表明，金黄色葡萄 球菌SHZ1 株FnBP 基因与Genbank 上公布的金黄色葡萄球菌FnBP （序列号为 EF127872 ）的核苷酸序列同源性为99.86% 。核苷酸序列中有两个碱基发生变异， 但均为同义突变。金黄色葡萄球菌SHZ1 株ClfA 基因与Genbank 上公布的金黄 色葡萄球菌ClfA （序列号为EF207779 ）的核苷酸序列同源性为96%，氨基酸序 列的同源性为100%。 2 、金黄色葡萄球菌FnBP 基因重组牛痘病毒的构建、鉴定与纯化研究：将 用 Sam Ⅰ单酶切将目的基因切下，并克隆至pSC11 牛痘病毒载体，测序鉴定正 向连接的阳性克隆。选择正向连接的重组转移质粒pSC11-FnBP ，利用脂质体转 染法将重组转移质粒转染已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21 细胞中，收获转染产 物，并反复冻融，然后充分稀释接种BHK-21 细胞，利用蓝白斑筛选重组牛痘病 毒，连续传代纯化蓝色蚀斑，结果传代 5 次后得到较纯的重组牛痘病毒。利用 PCR 技术、RT-PCR 技术及Western-blotting 检测经纯化后得到的重组牛痘病毒， 证实外源基因FnBP 已成功重组到牛痘弱毒株病毒基因组中，并随着牛痘弱毒株 病毒在BHK-21 细胞内的生长、繁殖而复制、转录和翻译。 3、金黄色葡萄球菌FnBP 基因重组牛痘病毒的生长特性、安全性及免疫原 性初步研究；利用 BHK-21 细胞测定非重组牛痘病毒与重组牛痘病毒的毒价 （TCID50 ），结果表明重组外源基因的重组牛痘病毒与非重组牛痘病毒的毒价相 比并没有降低。重组牛痘病毒pSC11-FnBP 作为实验组，生理盐水和牛痘弱毒株 病毒作为对照组，对小鼠进行了实验免疫研究。通过对免疫小鼠体征及内脏器官 进行病理切片观察，结果证实重组牛痘病毒pSC11-FnBP 对免疫小鼠无任何不良 反应，具有良好的安全性。通过检测重组牛痘病毒免疫小鼠血清中IFN-γ和测定 中性粒细胞吞噬功能证实构建的重组牛痘病毒与牛痘弱毒株病毒相比可诱导机 体产生较好的细胞免疫。攻毒试验表明，重组牛痘病毒对金黄色葡萄球菌具有一 定的免疫保护作用。本研究为金黄色葡萄球菌新型疫苗的研究奠定了一定的基 础，同时也为奶牛乳房炎的免疫防控研究提供一个新的思路。 关键词：金黄色葡萄球菌；FnBP 基因；ClfA 基因；牛痘弱毒株病毒；重组 牛痘病毒 I 金黄色葡萄球菌保护性抗原基因重组牛痘病毒的构建与鉴定研究 Abstract Staphylococcus aureus is one species of gram positive coccuses which can infect many animals. The bacteriological investigation showed that Staphylococcus aureus is one of the important pathogens that cause dairy cattle mastitis, which has endangered the cow breeding industry. In order to prevent and control of dairy cattle mastitis effectively, it is