h5n1亚型禽感病毒单克隆抗体的制备与血凝素ha基因的体外高效表达和纯化.pdf

摘要 加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行融合，以两株病毒全病毒作为包被抗原进行ELISA 选，通过4次的亚克隆获得了6株杂交瘤细胞，均可以稳定地分泌抗HA的抗体，依次命名为 制检测，HA特异性六株杂交瘤细胞可以和绝大部分禽流感病毒毒株结合，具有较好的广谱性和 稳定性。染色体数值符合脾细胞与骨髓瘤细胞的染色体数目之和。六株杂交瘤细胞的HI效价依次 10 12 为：212、212、211、2 2 210。血凝试验结果表明所制备杂交瘤细胞与禽流感病毒其他亚 型及新城疫病毒无交叉反应。经冻存复苏后，仍具有较高的抗体水平，所获杂交瘤细胞均与感染 了相应H5亚型AIV的293T发生特异性结合，捕获荧光标记的二抗，在荧光显微镜下发出明亮的绿 诊断提供良好的物质基础，为研究病毒HA抗原结构与功能提供物质手段。 根据AIV 构建好的重组转移载体转座DHl0感受态，进而获得重组的转座子，通过转染昆虫细胞获得重组 定，同时做免疫荧光鉴定，鉴定阳性的蛋白用纯化带His标签蛋白的方法进行纯化，并将纯化好 的蛋白经过凝胶过滤层析分离低聚物和三聚体，获得浓度较高并具有血凝活性的三聚体蛋白，为 H5亚型流感病毒可能抗原结构位点的预测和定位提供基础。 关键词：禽流感H5亚型，单克隆抗体，蛋白表达及HIS标签纯化，凝胶过滤层析 I／I Abstract In in this ofavianinfluenzarecent ofavianinfluenzavirus study，monitoring years，theseparation H5NIstrain 147／2010 subtype A／Chicken／Guangdong／$2261／2009(HSNI)andA／Chicken／Jiangsu／S1 4to6weeksBALB／cmiceimmunizedthreetimesand the 0qSNI)isbyimmunizing strengthen immunecellsand cellsSP2／0 strainsofthevirustothewholevirusas spleen myeloma fusion,two for the inhibition ELISA，andhemagglutinationtest(HI)testscreening,the coatingantigen positive forindirect 4 cellslimiteddilutionandselection ELISA timestOobtainthesix by test,by hybridoma secreteanti-HA thenameGD261 1 subclone，c锄steadilyantibody,followedby 1A4，GD262F5， monoclonalof H5 GD2613D3，JSl47185，JSl474DI，JSl475C5．HA—specificsubtype