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独创性声明 本人声明，所呈交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位(毕业)论文作者亲笔签名：落咿 日期：少形’多·珍 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。町／ 学位(毕业)论文作者亲笔签名：艰 日期： ≯谚．石：哆 指导教师亲笔签名： 日期：溯‘‘、哆 福建农林大学硕士论文 RGD-Melittin融合基因的表达纯化及活性测定 中文摘要 免疫毒素是一类特异杀伤肿瘤细胞的药物，能以抗体或细胞因子为导向载体 (该抗体或细胞因子能与肿瘤细胞表面特异表达的抗原或受体结合)同毒素相 连，对肿瘤细胞进行特异杀伤的嵌合蛋自。正电性抗菌肽由于其独特的细胞毒机 制日益引起人们的关注，而蜂毒溶血肽作为其中典型的一种，具有多种生理活性。 甘一天冬氨酸三肽)为靶向部分，构建膜毒性免疫毒素RGD—Mel；并用pET-30a为 表达载体，对嵌合蛋白进行了重组融合表达，初步检测了该嵌合蛋自的体外活性。 本研究得到的主要结果如下： 从处于活跃表达蜂毒溶血肽时期的中华蜜蜂工蜂毒腺中提取了总RNA，用 发现，与在37—42℃用AMV进行反转录相比，在较高温度下用TaqDNA聚合酶进 行反转录有利于获得正确、完整的cDNA。 用pUCl8载体构建的pUCT克隆载体克隆了中蜂Melittin成熟区的cDNA， 测序结果显示中蜂Melittin成熟区序列与意蜂的相比，中蜂在第33位发生了一 个碱基的差异，但这一变异对氨基酸序列无影响，即中蜂与意蜂Melittin的氨 基酸序列完全一致。 本文采用基因工程的方法，将RGD与中蜂Melittin连接，以大肠杆菌为重 组表达宿主，pgT30a为表达载体，对该嵌合蛋白进行了高效表达，并分离纯化 了该融合蛋白。经体外细胞实验初步证明该融合蛋白有明显的肿瘤杀伤作用：当 天然蜂毒素的浓度达到5．0I．tg／mL时，其肿瘤抑制率为39．6％，RGD—Mel在浓 度为5．0斗g／mL时，其肿瘤抑制率已达到45．5％，且RGD—Mel浓度为3．0pg／mL 时的肿瘤抑制率已相当于天然蜂毒素在浓度为5．0p卧IlL时的抑制率。 重组蛋白RGD-Me]是一种膜毒性抗肿瘤免疫毒素，在体外表现了明显的肿瘤 杀伤活性，但尚需进行体内试验以进一步验证其抗肿瘤活性。本研究在肿瘤的导 向治疗和临床方面将有很大的潜在应用价值。 关键词：RGD肽蜂毒溶血肽融合基因活性测定抗肿瘤 福建农林大学硕士论文 RGD-Melittin融合基因的表达纯化及活性测定 and ofRGD—Melfusion Prokarytic bioactivity expression，purification gene Abstract Theimmunotoxinisa anti—tumor itCan combine special medicine， exactly to the or onthetum