tgf-β1、fgf和pdgf在奶牛乳腺纤维化中作用的研究.pdf

摘 要 奶牛乳腺纤维化主要是由乳腺炎引起的一种常见的病理过程，而乳腺炎是奶牛 的主要疾病之一，其发病率和感染率在国内外均较高，可引起奶牛乳腺不同程度的 纤维化过程。纤维化的乳腺泌乳量降低，严重时可发展为乳腺硬化导致奶牛淘汰， 给奶牛业造成严重的损失。 组织器官的纤维化过程主要取决于细胞外基质 （ECM ）的沉积、分解和相关细 胞凋亡等方面，并与转化生长因子-β （TGF-β ）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ） 和血小板源性生长因子（PDGF ）等多种细胞因子密切相关。目前关于肝脏和肾脏 等组织纤维化的研究较多，而有关乳腺纤维化的研究较少，在乳腺纤维化过程中除 间质成纤维细胞产生 ECM 外，乳腺上皮细胞是否能转分化为肌成纤维细胞 （MFB ） 而产生 ECM 仍不明确。α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），结缔组织生长因子（CTGF ） 和胶原 Ⅰ （COL Ⅰ）是判断组织纤维化程度的主要指标，因此可通过检测此三项指 标表达量的变化，以确定细胞因子在纤维化过程中的作用。 为在体外培养纯化出稳定生长的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞，通过外科手 术的方法采取妊娠后期或泌乳期的荷斯坦奶牛乳腺组织，分离乳腺腺泡，用组织块 培养法体外培养奶牛乳腺细胞，应用差时胰酶消化法和差速贴壁法将奶牛乳腺上皮 细胞和成纤维细胞两种细胞分别纯化出来，并用免疫组化的方法对细胞的纯度进行 鉴定。将不同浓度的 TGF-β1 （0 ，1，5，10ng/ml）、bFGF （0 ，5，10，20ng/ml ）和 PDGF-BB （0 ，5 ，10，20ng/ml ）三种外源性细胞因子分别作用于体外培养的奶牛 乳腺上皮细胞和成纤维细胞，于不同的时间点（12h，24h ，48h ，72h ）提取细胞的 总 RNA 和总蛋白，以 β-actin 作为内参基因，用 Real-Time RT-PCR 方法测定两种细 胞中 α-SMA、CTGF 和 COL Ⅰα1 mRNA 相对表达量的变化，其 PCR 产物进行测序 分析；并用 Western blot 方法测定相应蛋白的表达。 研究结果表明：纯化的奶牛乳腺上皮细胞多为多角形，细胞核圆形或椭圆形， 核仁清晰可见，多成鹅卵石样或铺路石样生长，并可分泌乳滴，角蛋白-18 反应阳 性，波形蛋白反应阴性；纯化的奶牛乳腺成纤维细胞多为长梭形，成旋涡状或放射 状生长，角蛋白-18 反应阴性，波形蛋白反应阳性。经纯化后两种细胞的纯度均可 达 95% 以上，可满足后续试验的要求；外源性 TGF-β1 能够有效上调体外培养的奶 牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞中 α-SMA、CTGF 和 COL Ⅰα1 mRNA 及 α-SMA 蛋白 的表达，并成一定的量效关系；外源性 bFGF 对体外培养奶牛乳腺上皮细胞和成纤 维细胞 CTGF mRNA 的表达起促进作用，对成纤维细胞 COL Ⅰα 1 mRNA 的表达主 要起促进作用，对奶牛乳腺上皮细胞 COL Ⅰα1 mRNA 表达的作用不明显，高浓度 的bFGF 对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞 α-SMA mRNA 的表达均有抑制趋势，与 α-SMA 蛋白表达的结果不是很一致。外源性 PDGF-BB 对奶牛乳腺上皮细胞和成纤 维细胞 CTGF 和 COL Ⅰα1 mRNA 的表达主要起促进作用；对奶牛乳腺成纤维细胞 α-SMA 蛋白的表达起促进作用，较低浓度时对奶牛乳腺成纤维细胞 α-SMA mRNA 的表达起促进作用；而高浓度时对奶牛乳腺上皮细胞 α-SMA mRNA 的表达有抑制 趋势，与 α-SMA 蛋白表达的结果不是很一致。经测序分析，奶牛乳腺上皮细胞和 成纤维细胞中目的基因 CTGF、α-SMA 和 COL Ⅰα1 的扩增产物序列一致，且通过 比对分析得出其扩增产物均为牛的 CTGF、α-SMA 和 COL Ⅰα1 。 研究证实：组织块培养法结合应用差时胰酶消化法和差速贴壁法能够在体外培 养并纯化出稳定生长的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞两种细胞 。外源性 TGF-β1 对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞 α-SMA、CTGF 和 COL Ⅰα1 的 mRNA 及 α-SMA 蛋白的表达均具有促进作用，表明 TGF-β1 能够促进奶牛乳腺上皮细胞转分化和细 胞外基质的产生。外源性 bFGF 对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞 CTGF mRNA 的 表达起促进作用；对成纤维细胞