一种新的来源于的穿膜肽的功能和对生物节律影响的研究.pdf

本课题部分受国家自然科学基金资助 一种新的来源于人的穿膜肽的功能和对生物节律影响的研究 一种新的来源于人的穿膜肽的功能和对生物节律影响 的研究 摘要 研究生 彭涛 导师 王正荣 locomoter 目的研究一种新的人体蛋白结构域(Circadianoutput hCLOCK’S cycleskaputprotein’SDNA-bindingpeptide． DNA—BIND，hClock一(35—47))对多种细胞细胞膜的穿膜作用及其通过 大鼠血脑屏障的作用。在此基础上，进一步探讨了hClock一(35—47) 通过细胞膜的一些相关机理，及其内化入细胞后对细胞近R节律基因 转录的影响。 方法化学合成hClock一(35-47)，N端标记FITC绿色荧光素，与培 养的血管内皮细胞(ECV一304)和原代培养的神经胶质细胞孵化一定 时间后，荧光显微镜下观察其对多种细胞细胞膜的穿膜作用，并采用 4．5for Image—ProPlus(VersionWindows“)来分析细胞荧光强度。 采用MTT比色实验测定hClock一(35—47)的细胞毒性。在此基础上， 经大鼠颈总动脓注射hClock一(35—47)后，傲大鼠大脑冰冻切片，荧 光显微镜下观察其通过大鼠血脑屏障进入脑细胞的情况。在培养基中 加入肝素，通过在荧光显微镜下观察标记FITC的bClock一(35-47)内 化入细胞的情况，来了解肝素对hClock一(35—47)内化入细胞的抑制 一种新的来源于人的穿膜肽的功能和对生物节律影响的研究 作用。用成年马的血清休克培养的NIH3T3小鼠成纤维细胞，诱导细 胞的近日节律基因mRNA转录水平表现近日节律变化。利用流式细胞 仪检测hClock一(35-47)在不同时间点内化入NIH3T3细胞的相对量。 将hClock一(35—47)内化入马血清休克的NIH3T3细胞后，通过 mRNA，来研究hClock一(35—47)对细胞 RT—PCR半定量检测perl 近日节律基因转录的影响。 结果hClock一(35-47)不仅能有效的进入每一个细胞，而且似乎对 细胞无选择性，既能透过ECV一304细胞的细胞膜，又能透过原代培养 的神经胶质细胞的细胞膜。其内化的量随孵化时间和肽段浓度的增加 而增加。hClock-(35—47)与人体蛋白的氨基酸序列完全相似，从而避 免了给人体带来潜在致病性和免疫源性。用MTT比色实验测定 hC]ock一(35—47)的细胞毒性，结果浓度l00州的hClock一(35—47)与 孵化24h后，细胞生长来见抑制。在此基础上，我们进一步研究证明 hClock-(35-47)能够通过大鼠血脑屏障进入脑细胞中，这为研究治疗 中枢神经系统疾病药物的载体提供了新的有效途径。我们也发现，肝 素对hClock一(35—47)内化入细胞有抑制作用，根据这点我们考虑可 能是因为hClock一(35-47)为蛋白的DNA结合结构域，含有4个精氨 酸和3个赖氨酸，带有很强的正电荷，能够与细胞膜上磷脂分子所带 的负电荷相互作用，介导了大分子的跨膜。我们还检测了 hClock一(35-47)在不同时间点内化入细胞量呈近日节律变化 上受到近日钟系统调节的功能单位有关。此外，我们研究发现 录水平，从而使perlmRNA转录的近日节律的中值减小。这可能是由 2 一种新的来源于人的穿膜肽的功能和对生物节律影响的研究 于hClock一(35—47)能够竞争性的结合在DNA的特定区域，而影响 hClock—BMALl二聚体结合到DNA的这一区域，从而减弱perl基因 的转录。 结论hClock-(35-47)既具有很强的内化作用，又对人体具有完全的 安全性，这些特点为研究安全通过细胞膜屏障和血脑屏障的药物载体 提供了有效途径，可能具有广泛的临床应用前景。hCl