应用ssh技术选和克隆奶牛乳房炎抗性相关基因.pdf

Y937416 摘要 乳房炎是造成奶牛业损失最严重的疾病之一，尽管在许多国家都广泛地实旖 了乳房炎防制措施，但它仍然是世界奶牛业面临的最大威胁。研究表明，奶牛乳 房炎抗性在种间和种内都存在显著的遗传差异，通过遗传选择提高乳房炎抗性可 能是解决这一重大疾病最好的长期策略。由于人们目前对控制奶牛乳房炎抗性的 相关基因及其分子机制等还不清楚，这就严重阻碍了人们通过治疗、免疫接种和 遗传选择等途径来显著提高奶牛对乳房炎的整体抗病力。本研究旨在通过分离和 克隆与奶牛乳房炎抗性相关基因的探索性研究，初步揭示参与乳房炎抗性的基因 种类和数量，为进～步深入丌展乳房炎抗性的分子机理研究及将来通过遗传选择 提高乳房炎的抗性提供理论基础。本研究取得的主要结果如下： 1．应用抑制性消减杂交(SSH)技术成功构建了患乳房炎奶牛与健康奶牛外周 血白细胞差异表达cDNA文库。以经产荷斯坦奶牛外周血白细胞为材料，分离 的片段。将患乳房炎奶牛cDNA分成两组，分别与2种不同的接头连接，再与 Easy载体连接，转化大肠杆菌TOPl0感受态细胞进行文库扩增， 纯化后与pGM—T 最终构建得到了具有高消减效率的奶牛乳房炎抗性相关cDNA文库。文库扩增 后得到610个白色阳性克隆，随机挑选16个克隆进行PCR鉴定，鉴定结果表明 插入片段主要分布在250-750bp之间。 个差异表达的克隆。分别用地高辛标记患乳房炎奶牛和健康奶牛cDNA作为杂 差异表达克隆，测序后得到48个质量合格的EST序列。根掘在GenBank非冗余 第一一类代表已知基因，共35个；第二类代表已知EST，共5个；第三类为新EST， 共3个。代表已知基因的ESTs按照基因功能分为八类：信号转导与细胞间通信、 细胞结构与运动、细胞凋亡、细胞与机体防御、物质转运、翻译与表达调控、代 谢及其它。结合相关文献初步探讨了部分患乳房炎奶牛差异表达基因的作用和意 房炎抗性中发挥重要作用。 3．电子克隆了牛Znf313基因完整编码序列。将差异表达克隆编号为68的EST 果设计引物，进行RT-PCR，扩增产物克隆入质粒载体，测序得到的序列已被 基因，丌放阅读框1-693bp，编码230个氨基酸，预测其编码蛋白分子量为 25．67kD，等电点6．90。 4．电子克隆了牛PSMEl基因完整编码序列。以人PSMEI基因完整编码序列 NM 006263为种子序列电子克隆了牛PSMEI基因完整编码序列，设计引物进行 RT-PCR，扩增产物克隆入质粒载体，测序得到的序列已被GenBank收录，序列 249个氨基酸，预测其编码的蛋白分子量为28，66kD，等电点5．87。 关键词：奶牛：乳房炎抗性；抑制性消减杂交；基因表达；PSMEl基因：Znf313 基因；差异筛选：cDNA文库 Summary Bovinemastitisisa the disease，whichremainsmost diseasetothe complex costly worldwide the of dairyindustry,despitewidespread mastiffscontrol implementation differencesofmastitisresistancebetweenbreedsandwithinbreedin strateges．Genetic COWSare selectionto mastiffsresistance dairy significant，SOgenetic improve be