猪胸膜肺炎放线菌感染特异性诊断方法的建立：pcr和夹心elisa.pdf

张志妮《APP感染特异性诊断方法的建立：PcR和夹心ELIsA方法》 ! 猪胸膜肺炎放线杆菌感染特异性诊断方法的建立： PCR和夹心ELISA 专业：预防兽医学 研究生：张志妮 导师：朱国强教授 中文摘要 猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌口cf伽06口cfⅣ螂p肠甜仰，ze“，，zD聆缸P， APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病，给集约化养猪业造成严重的经济损 失，该病以出血性坏死性肺炎和纤维素性胸膜炎为特征，APP有两个生物型，15 个血清型。 猪传染性胸膜肺炎最急性型引致猪的急性死亡，无临床病症慢性感染猪往往 是再次爆发和流行的潜在传染源，感染猪易引发其它病原的继发感染。所以APP 感染的早期诊断成为防控该病的关键。 toxins，Apx)是最重要的毒力因子。其中彬Ⅳ基因只在活体内表达，体外培养则 不表达该毒素，唧Ⅳ基因存在于所有血清型中且高度保守，具有种特异性。 本研究致力于提高、完善APP感染的诊断技术，建立PCR诊断方法并开发 研制央心ELISA试剂盒。 1、建立APP生物I型的PCR诊断方法 PCR是一种快速的病原学诊断方法，本研究据已发表的卿Ⅳ毒素基因序列 1～12 片段，而副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪放线杆菌、猪霍乱沙门氏菌、奇异变形杆 菌、支气管败血波氏菌、猪丹毒杆菌PCR扩增结果为阴性。可检出最低活菌数为 2x 102c列mL，最低检出DNA浓度为9pg。 2、重组蛋白rApxIV的表达 扬州人学硕十学何论文 cD疗BL mM 列分析后将此重组质粒转化E IPTG诱导4h获得高效表 21(DE3)，O．1 达的重组蛋白His．ApxⅣ，SDS．PAGE、Westem blot检测证实rApxⅣ分子量为35．3 和层析试剂盒进一步纯化。 3、单克隆抗体的制备及双抗体央心ELISA方法的建立 按常规方法制备单克隆抗体。以纯化的重组蛋白rApxⅣ免疫BALB／c小鼠， 取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／O进行融合，以rApxⅣ和表达宿主菌的菌体蛋白为 检测抗原，进行杂交瘤细胞的筛选，三次亚克隆后挑选两株分泌稳定、为IgG的 杂交瘤细胞：587、5C11，竞争性结合试验证明它们有不同的抗原结合表位。这 法纯化单抗。纯化的587用标准生物素方法进行标记并测得标记效价为106。建 立检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA方法，方阵滴定法确定捕获抗体最佳工作 60pg／mL。 将建立的PCR和双抗体夹心ELISA分别检测10份猪病变肺组织和血清样品， 阳性6份，与细菌分离鉴定结果一致，三种鉴定方法结果相符合。表明本研究建 立的PCR和双抗体央心ELISA方法都可用于APP感染的临床诊断。 关键词：APP；伽Ⅳ基因：PCR；双抗体夹心ELISA；单克隆抗体 张志妮《APP感染特异性诊断方法的建立：PCR和夹心ELISA方法》 Detectionof彳c矿f阳D6口cZ，，甜s p彪扰，．Dp以e扰聊D耽f口P PCRandsandwichELISA by Zhini M．S．Candidate：Zhang