家蚕微孢子虫nbombycis三种表面蛋白的纯化、性质及表面蛋白p30.4基因的克隆分析.pdfVIP

擅 要 于从无脊椎动物如蚕、蜜蜂、虾、蟹和鱼类等到脊椎动物，并造成了不同程度的 经济损失。可见展开对有关微孢子虫的研究对于稳定生产、卫生防疫和环境生态 诸方面有着重要意义。养蚕业作为我国的传统产业，在农业上一直占有重要的经 济地位。而由家蚕微孢子虫Ⅳbombycis引起家蚕微粒子病则是养蚕业的毁灭性 病害。由于能够胚种传染，一直被列为蚕种检疫的唯一对象。现在生产上又不断 发现形态、大小等不同的异型微孢子虫，给微孢子虫的检疫与病害防治造成了困 难。因此这一领域一直是蚕病学的研究热点。鉴于微孢子虫体积小、孢壁厚等特 点，其分子生物学研究起步较晚，还没有关于家蚕微孢子虫州bombycis蛋白编 码基因的报道。微孢子虫表面蛋白不仅在微孢子虫免疫血清学诊断上具重要意 义，在微孢子虫致病感染识别上也可能具有重要作用。鉴于此，本研究以家蚕微 孢子虫^(bombycis的表面蛋白为研究对象，试图对其进行分离纯化和相关基因 的克隆分析。觋将研究结果报告如下： 采用Percoll法对三种感染家蚕的微孢子虫Ⅳbombycis、SCMf；(Nosema．sp) 和SCM，(Endoreticu]atus bombyci曲进行纯化，得到的微孢子虫的折光性和均一 性一致，无组织碎片，纯度高。然后以SDS法提取以上三种微孢子虫的部分表面 蛋白。三种微孢子虫虽然都能够感染家蚕，但形态、大小及病原性各不相同，将 三条主带，sc№有三条到四条，SC地带数较多，且均一，有一条主带较明显。即 使是同属异种的ⅣbombycJs和sc也的表面蛋白的多态性也十分明显，这可能是 微孢子虫适应不同的寄生环境的结果．反应了微孢子虫表面蛋白与病原的种类、 致病性及抗原性的关系，对进一步进行分类和致病机理的研究提供新的依据。 理去除表面蛋白后微孢子虫对家蚕的致病力明显下降，说明微孢子虫表面蛋白对 微孢子虫的侵染、致病有一定的影响作用。 通过制备性SDS—PAGE、高效液相色谱反相HPLC层析等纯化手段对家蚕微孢 子虫Ⅳbombycis的三种主要表面蛋白进行了纯化。纯化过程中以家蚕微孢子虫 段分析都分别表现为单带，符合测序的要求。同时测定了三种主要表面蛋白的分 量大小分别命名为P32．7、P30．4和P25．3。 对表面蛋白P30．4采用Edman降解法进行了N端氨基酸测序，N端10个氨基 ProThr HiSHiS Ala一3’。 酸序列为5-Glu Arg AspArgTyr 以N端氨基酸序列为基础合成简并引物，利用快速扩增eDNA末端I{AcE法， 以eDNA为模板进行扩增，得到一个大小为800bp左右的DNA特异片段。其编码 鉴定，与mRNA有一条强烈的杂交信号带。 为了进一步分析，采用T-A克隆法对该目的片段进行了克隆，采用酶学的双 一个完整的基因。推算分析表明，此完整基因转录翻译后的氨基酸分子量为30．2kD 等电点为7．88，与实际得到的P30．4蛋白质的分子量、等电点十分相近。说明 克隆得到的基因正是目的蛋白质P30．4的基因。 通过BLAST软件比较分析表明，实际克隆到的片段与两个与膜蛋白有关的蛋 这两种已知前者是关于一种细菌Ureap]asma membrane 1ipoprotein，后者是记录一种真菌Saccharomyces w(1．8)软件分析，P30．4蛋白质的氨基酸的第91号的N， protein。经CLUSTAL 第190号的F，第198号的L等，在三种蛋白质中是高度保守的部分。此外还有 相对保守的多个部位，这三种蛋白质的二级结构也极其类似，都呈多个折回结构， 包括三个组成部分，各部分之间由。一螺旋结构或者片状结构相连接。尤其是P30．4 membrane 与Hypotheticallipoprotein之间呈高度类似性，都由20个左右氨 membrane 基酸的折回结构组成。P30．4是由两个Q一螺旋结构相连，Hypothetical 出由两个螺旋结构相连的3个结构区域，只不过起联络作用的螺旋和片状结构较 前两种蛋白质的短，该蛋白质由26个左右氨基酸的折回结构构成。三种蛋白质 之间的高度保守区域都位于整个蛋白质的中心部位，在二级结构上，保守序列多 位于第二个结构