无色孔雀石绿单隆抗体的制备及elisa检测方法的建立.pdfVIP

中文摘要 孔雀石绿(MG)是一种抗寄生虫和抗细菌类药物，广泛应用于水产养殖业，用 于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病等，并获得了极佳的效果。由于MG及 其代谢产物无色孔雀石绿(LMG)在水产动物体内具有明显的高残留、高毒性、致 癌、致畸、致突变等副作用，该药在动物食品中的残留问题已经引起了人们的高度重 视，许多国家都将MG列为水产养殖禁用药。 目前，国内外建立了理化分析和微生物方法，如薄层色谱法(TLC)、高效液相色 无法适合于规模筛选。间接竞争性酶联免疫法(ciELISA)，具有快速、准确和无污染 等优点，已经被广泛运用于药物残留的分析，获得高质量的单克隆抗体(McAb)是实 现免疫分析的核心。与多克隆抗体(PcAb)相比较，McAb具有特异性强、均质性好、 易于标准化等优势。国外已有成套的MG及其代谢物LMG的ELISA试剂盒上市， 但我国用于MG检测的ELISA试剂盒主要依赖进口。因此，本研究对探索制备高质 量的McAb，为自主研制ELISA试剂盒打下良好基础。 本试验用人工合成的无色孔雀石绿．牛血清白蛋白(LMG—BSA)作免疫抗原，分 别免疫68周龄健康BALB／cdx鼠。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐 剂有弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。四免以后，小鼠血清ciELISA效价均达到 机体产生较强的免疫应答。 采用50％PEG作为促融剂，将免疫脾细胞和SP2，o骨髓瘤细胞融合。融合后3～ 5d，可见呈葡萄状分布的融合细胞小集落克隆，细胞数多少不等。经鉴定：本试验获 得的杂交瘤细胞染色体数目为99．12+3．6，小鼠脾细胞的染色体数目为40，而SP2，0 的杂交细胞。细胞融合率为86．32％，其中单个细胞克隆分泌抗体阳性率为4．56％。 经过对杂交瘤细胞的筛选和克隆化，共获得6株杂交瘤细胞株，从中筛选出1株效价 高、特异性强的稳定分泌LMG单克隆杂交瘤细胞株，命名为2E6。经过3次亚克隆， 克隆阳性率达100％。经多次冻存及复苏，杂交瘤细胞仍能保持稳定的抗体分泌能力。 用ciELISAi烫IJ定显示LMG50％抑制质量浓度为20．39ng／mL，诱生小鼠腹水的抗 体效价达1：2．3x106。采用ciELISA计算出2E6McAb与各种化合物的交叉反应率，结 果表明，2E6McAb与参与测试的2种同类药物MG、LMG有交叉反应率，对参与测试 的其他5种水产养殖中常见禁用激素和抗菌药物已烯雌酚、氯霉素、副品红、甲基兰、 四环素无任何交叉反应性。表明本试验获得的McAb具有较好的敏感性和特异性，为 试剂盒的研制打下了基础。 关键词：孔雀石绿：无色孔雀石绿；单克隆抗体；间接竞争酶联免疫法 Abs仃act Malachite akindof and has anti-bacterialthat been Green(MO)isanti·parasitic drug in usedthe forthe andthetreatmentof widely aquaculture diseasesof prevention aquatic aswater animals，such results．AstheMGand mildew,gillphthiriasis，etc，and getsgood Malachite itsderivedLeuco of product Green(LMG)arehighresidual，hightoxic，