全新hplc体内药物分析实用技术.ppt

生物样品的预处理 液-固萃取法 固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 SPE的种类 生物样品的预处理 固相萃取步骤 活化 被分析物 上样 冲洗 洗脱 杂质 根据SPE及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开，让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附 生物样品的预处理 由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取 为了测定尿液中药物总量，无论是直接测定或萃取分离之前，都需要将缀合物中的药物释出 有些药物仅需较温和条件即可使药物游离，有些则需较剧烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法 体内药物分析 体内药物分析方法应用示例 应用示例 苯妥英钠 C15H11N2NaO2 274.25 常用抗癫痫药物 有效血药浓度范围(10～20 ug/ ml) 应用示例 具有环状酰脲的结构，可因互变异构成亚胺醇式，而显酸性，pKa约为8.3 本品在水中易溶，在乙醇中溶解，在三氯甲烷或乙醚中几乎不溶 应用示例 （1）光谱条件 紫外波长：250 nm 样品处理　 血清加pH 6.8 磷酸盐缓冲液0.5 mL ,旋涡混合后加二氯甲烷0.5 mL ,振荡,离心,吸取下层有机层4.0 mL ,用7 mol·L-1NaOH 2.0mL 回提,吸取碱液层,加0.5 mL 饱和KMnO4 溶液,混匀后80 ℃水浴加热20 min ,放冷,加2.5 mL 环己烷,旋涡混合,离心,取上层溶液,以环己烷为空白, 测定吸收度(A) 应用示例 （2）色谱条件　 流动相:甲醇 流速:1ml/ min 检测波长:240 nm 样品处理　 血清,置EP 管中,加无水乙醇至乙醇浓度为70 % ,充分振荡后, 离心，取上清液置另一EP 管中，-20 ℃保存 应用示例 　苯妥英钠标准色谱图 　癫痫病人血样色谱图 应用示例 （3）色谱条件　 Symmetry C18柱, 4. 6 mm ×150 mm, 5. 0μm 流动相:甲醇∶水( 50 ∶50 ) 检测波长：254 nm 流速：1 ml·min-1 样品处理　 取血清0. 3 ml加入乙酸乙酯4 ml后混旋振荡离心，取上清液3 ml于50℃水浴中经氮气挥干,取残渣用0. 1 ml甲醇复溶后,取20μl进样 应用示例 空白血清 含药血清 应用示例 （4）色谱条件　 色谱柱Nava-park C18柱(3.9 mm×150 mm ,4.8μm) 流动相:甲醇-水(50∶50) 流速1.0 ml·min - 1 检测波长210 nm 样品处理　 血清100μl , 加入含内标物4-氨基安替比林10μg·ml - 1的乙腈溶液250μl ,涡旋离心,取上清液10μl 进样,按内标法计算样品浓度。 应用示例 A:空白血浆 B :苯妥英血浆标准品和内标 C:患者的血浆样品 1 为4-氨基安替比林 2 为苯妥英 应用示例 （5） 色谱条件 Nova-pak C18柱(3.9 mm ×150 mm ,4μm) 流动相:甲醇-KH2PO4 (0.01 mol·L-1 、pH 3.50) (50∶50) 流量: 1 ml·min - 1 检测波长: 211 nm 应用示例 　样品处理 将Accubond SPE C18萃取柱(1 ml∶100 mg) 安装于SPE 装置上,调整至负压 分别用甲醇2 ml , NaH2PO4缓冲液2 ml 依次活化,平衡 取样品液1ml 上柱 依次用NaH2PO4缓冲液2 ml 、15 %甲醇(甲醇-NaH2PO4缓冲液为15∶85) 2 ml 淋洗 用甲醇0.5ml 洗脱,直接进样 应用示例 　苯巴比妥(PB) 、苯妥英钠(DPH) 和卡马西平(CBZ) 应用示例 （6） 色谱条件 Diamonsil C18 柱(250 mm ×416 mm , 5μm) 流动相：甲醇-水(65 ∶35) 流速：1 mL/ min 紫外检测波长：225 nm 样品处理 血浆200μL 加内标液10μL ,加5 %硫酸锌溶液10μL ,旋涡振摇, 高速离心,取上清液进样 应用示例 系统适应性实验 系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对色谱系统进行试验，应符合要求。