外源dsrna甘蔗花叶病毒干扰调控研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 摘摘 要要 玉米（ZeamaysL.）是重要的粮食作物与饲料作物，也是现代蔬菜、食品、医药 与化学工业的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花叶病成了限制我国玉米产量 与质量的重要因素。传统的育种方法由于抗性资源的匮乏及物种间的遗传隔离，使抗 病育种工作受到了极大的限制。利用基因工程技术对玉米进行遗传改良，以增强玉米 抗病虫与耐逆境能力，提高产量，改善品质，这成为玉米遗传育种的一个新方向。植 物抗病毒基因工程的策略有多种，研究表明利用RNAi 原理介导的抗病性特异性强， 比较容易获得高抗甚至免疫的转基因植株，为作物抗病毒基因工程提供了更有效的途 径。本文利用RT-PCR 扩增甘蔗花叶病毒cp基因特异性干涉片段，构建原核表达载 体LMCP，利用IPTG 诱导表达，并对诱导条件进行优化，利用细菌表达的dsRN A 提取液处理玉米植株，分析外源dsRNA 抗SCMV 的效果。结果表明： 1、 根据甘蔗花叶病毒cp基因序列设计特异性引物，RT-PCR 扩增甘蔗花叶病毒 cp基因上游及下游147 bp 和140 bp 的干涉片段。 2、 利用pUCCRNAi 克隆载体构建甘蔗花叶病毒cp基因反向重复序列克隆载体 pUCCRNAi + 2 F，再插入到原核表达载体 L4440 中，构建原核表达载体 LMCP，转化大肠杆菌HT115。 3、 利用 IPTG 诱导并对诱导条件进行优化，结果表明，LMCP 在大肠杆菌 HT115(DE3) 菌株中可表达产生预期大小的dsRNA 片段。而且当IPTG 浓度为 0.4~0.6 mmol/L，诱导4 h 左右时表达量最高。 4、 利用不同细菌表达的dsRNA 提取液喷洒4 叶期玉米植株，结果发现，LMCP1 dsRNA 及LMCP2 dsRNA 对甘蔗花叶病毒的干涉效果明显，而且 LMCP1 dsRNA 的处理效果较LMCP2 的好。 5、 通过对dsRNA 的处理浓度、接种病毒的时间（持效期）、渗透性等参数进行 优化。结果表明，外源dsRN A 提取液对甘蔗花叶病毒具有免疫作用，当dsRN A 稀释1/5 以内时，对病毒侵染的干涉作用明显，当超过1/15 时，处理效果大 大下降。dsRNA 喷洒后3 d 之内接种病毒，抗病效果明显，超过7 d 则不明 显。另外，添加一定浓度的渗透剂有利于提高外源dsRNA 的抗病效果。 综上所述，本实验成功构建了表达载体LMCP，优化了诱导表达条件，并且建立 了外源dsRNA 调控甘蔗花叶病毒的技术体系，为玉米及其它植物病毒病的防治提供 了依据。 关键词：甘蔗花叶病毒；RNAi 干涉；dsRNA；IPTG 诱导 I Abstract Abstract AAbbssttrraacctt Maize (ZeamaysL.) is one of the most important crops, staple food, forgage crop and industry materials. However viral diseases, particularly maize dwarf mosaic disease caused by Sugarcane mosaic virus and maize rough dwarf disease are among the most damaging diseases affecting maize production and quality in China. It is urgency to cultivate and popularize disease-resistant cultivar and sea