水稻温敏不育相基因rnai和过表达载体的构建及遗传转化.pdfVIP

摘 要 本实验室于2002年用具有明显育性转换特征的水稻温敏核雄性不育系Tb7S为 Sub仃犹dvc 材料，通过抑制性削减杂交(SuppressionHy嘶d幻蜥on，SSH)技术筛选减 数分裂期的Tb7S幼穗在高温可育和低温不育条件下的差异表达cDINA片段。经SSH 消减文库。并从可育幼穗cDNA消减文库随机挑取39克隆进行测序，但没有进行 Ikvc璐e№rthem Dot．b10t鉴定。 本研究选取上述39个克隆中的37个克隆进行Re邶e№mDot-b10t鉴定， 剔除假阳性后，共获得11个差异较明显的阳性克隆。 根据R-eVerSeNor出锄Dot-blot鉴定的结果，选取差异表达最明显的基因作为转 化水稻的目的基因。将选取基因的序列在水稻全长cDNA数据库进行比对，选取与其 他水稻基因连续相同的碱基数不超过21个的一段序列作为RN灿干涉片段，并根据 这段序列设计RNAi引物，克隆这些基因和删片段。测序表明，已经成功克隆到 选用pTCK303作为实施对、iA干涉和过表达策略的植物表达载体，将RN触片段 进行两次酶切连接，分两次连接到载体中，第一次正向连入，第二次反向连入，构建 83。 载体中，构建成过表达载体pTCK303．Os348、pTCK303．Os371、pTCK303．Osl 构建完成的RN加和过表达载体通过农杆菌介导方法转化水稻，经共培养、选择 肼、『A，进行PCR检测，4株扩增出目的条带，结果证明基因Os37l已经整合到水稻 基因组中。 关键词：水稻 温敏核雄性不育RN础过表达遗传转化 Abstract Tw0 Sub．嗽伽cDNAlib谢eshadbeenes协blished bymylabo僦呵吣啦tk Sub仃aCtive TWo—d眈ctio砌(f01ward锄d Hyb嘣i2斌ion(SS田 backwa叫)Suppression onthe and of cDNAsoffenile st矾le pe面med y0吼gpaIlicle youIlgp弛icle menn0一s哪itive malesterile clones丘哑也e蜘ilc genic rice(Tb7S)．39positive Sub仃active be如selectedfor aIldBLAST cDl姐librar)，had sequencmg a加1pis，but廿1cy hadnotbeenidentifiedI沁VerseNorChem by Dot-Blot． IIltllis 37cloneswereseleCted舶mtlle39clonest0beide以丘ed rese鲫m by哪iI唔 血e methodofIherseNornlemDot-Blotandobtailled11clonesthat expres∞d iIlme oftlleml0-sensitiVemalesterile