甜橙（citrs sinensis osbeck）红肉突变体类胡萝卜素合成相关基因的克隆与特性分析.pdf

Osbeck)红肉突变体类胡萝卜素合成相关 甜橙(Citrussinensis 基因的克隆与特性分析 捅要 柑橘红肉突变体果实富含多种对人体有益的类胡萝卜素。这些突变体不仅能为 研究柑橘芽变形成，而且还对研究柑橘果实类胡萝1-素代谢提供素材。本研究以甜 sinensis sinensis 橙红肉突变体红肉脐橙(C Osbeck)和红色暗柳橙(COsbeck)为 实验材料，分析了其果实发育过程中类胡萝I-素变化趋势和相关基因的表达；并构 建了红肉脐橙果肉cDNA文库，开发了部分EST．主要研究结果如下： 1、完善了柑橘成熟果肉的RNA提取方法。发现在RNA提取过程中，先用无水 乙醇去除果肉中的水分，能获得高纯度和高浓度的RNA样品。 2、对红肉脐橙和华盛顿脐橙8-11月份的果实类胡萝卜素总量和组分变化进行了 分析。结果表明：红肉脐橙果实中类胡萝I-素总量、番茄红素和八氢番茄红素比华 盛顿脐橙高。红肉脐橙果肉中伊胡萝卜素含量要高于华盛顿脐橙，但后者果皮a- 胡萝卜素含量比红肉脐橙高． 3、克隆并分析了红肉脐橙与华盛顿脐橙果实发育过程中类胡萝I-素合成途径9 个相关基因。结果表明： 1)红肉脐橙和华盛顿脐橙番茄红素卢环化酶基因(Lcyb)均为单拷贝等位基因， 有2个不同的转录本，这2个转录本之间有差异，但品种间没有差异。mRNA 原位杂交和RT-PCR分析表明，Lcyb表达量随果实成熟上升，但在红肉脐橙 白皮层中没有表达或表达量很低。 2)红肉脐橙和华盛顿脐橙八氢番茄红索合成酶基因(Psy)均为2个拷贝，两 者推导的氮基酸只有1个残基的差异。其表达量随着果实成熟而上升，但红 肉脐橙白皮层中Psy基因的表达量要比华盛顿脐橙高。 3)红肉脐橙和华盛顿脐橙番茄红素8环化酶基因(Lcye)为单拷贝基因。在果 实发育过程中均发生了选择性剪接，形成两个转录本，其中一个转录本缺失 14bp产生终止突变。包含缺失区的DNA含有2个6bp的正向重复。 等另外6个基因在红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中均有表达，但番茄 红素上游基因表达量要比下游基因高。对这6个基因的拷贝数分析表明，红 肉脐橙和华盛顿脐橙没有差异． 4，采用cDNA-AFLP研究了红肉脐橙和华盛顿脐橙果实发育过程中差异表达基 因。通过120对引物组合扩增，获得了1个在红肉脐橙果肉中增强表达的片断，并 V 个氨基酸，可能参与调节柑橘果实发育。 5、以12个甜橙品种为材料，采用同源序列法克隆了copia类反转录转座予的反 转录酶(RT)区域。序列分析表明，除梦脐橙和哈姆林甜橙一样外，其余的10个 RT序列高度异质。产生这种异质性的原因主要有移码、缺失、碱基替换、终止突 和Northern杂交没有发现copia类反转录转座予在红肉脐橙和清家脐橙果实和叶片 发育过程中的转录活性。 6、克隆了红色暗柳橙和暗柳橙Lcyb DNA全长(分别命名为HAVL毋,b和 II llHpa CRED—RA分析得到了1个可能发生DNA脱甲基化的位点，该位点与反转录转座子 有关。 7、以红肉脐橙不同发育时期果肉为材料，构建了一个eDNA文库。原始文库包 含有约5．086X105个克隆，重组率为94％，插入片段大小分布在400-2000 bp，平 均大小为900 bp左右。选取300个克隆进行了EST分析，获得了289个高质量的 EST。其中有125个EST与其他物种相应基因的氨基酸序列同源性大于50％；去除 重复EST后，获得了86个单一