鸭肠炎病毒部分因结构及相关功能的初步研究.pdfVIP

摘 要 viral 鸭病毒性肠炎(Duckenteritis，DVE)，又名鸭瘟(Duck plague，DP)，是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病，曾在多 个国家和地区发生流行，给养鸭业造成巨大的经济损失。DEV是疱疹病毒科成员，第八次病毒分 类报告将其划分为疱疹病毒科未分类病毒。由于DEV分子生物学研究相对滞后，其基因组组成 和结构未知，在很大程度上限制了DEV致病机制及该病在防控方面的研究。 本研究根据本实验室提交至GenBank上的DEVctone-03部分基因组序列。选择在疱疹病毒 中较为保守的囊膜蛋白UL27、主要衣壳蛋白ULl9以及在绝大多数疱疹病毒成员基冈组排列中 保守的基因簇(UL22-TK．UL24)进行测序。选取同源性较高的a一疱疹病毒同源蛋白作为参考毒 株，应用DNAStar软件对5个基冈进行序列比对，分析各个基因编码蛋白的保守区．结果表明， DEVclone-03 有跨膜糖蛋白典型特征，UL22具有7个糖基化位点。6个跨膜区，在N末端1-21位氨基酸为信 号肽序列，符合疱疹病毒gH糖蛋白的特点；UL27有9个潜在的糖基化位点，3个跨膜区，符合 疱疹病毒gB糖蛋白的特点。此外，根据5个基因编码氨基酸序列进行系统发育进化分析，发现 DEVclone-03与马立克病毒属亲缘关系较近，但又形成独立分支。根据这5个基冈比较结果，建 议将鸭肠炎病毒归类为疱疹病毒科、a一疱疹病毒亚科。 为了鉴定DEVclone-03结构基因．将DEV clone-03全 二段，应用Westernblot和问接免疫荧光方法检测6个重组蛋白的单因子血清与DEV clone．03 clone-03ULl9是病毒的结构蛋白，大小约为150kDa． ULl9蛋白大小一致，说明DEV clone-03ULl9可能是病毒的衣壳蛋 结合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区，初步认为DEV blot方法检测UL27，未能够在DEVclone-03中检测到预期大小的蛋白条带。 白。应用Western 但是，应用间接免疫荧光方法检测，UL27一M抗血清能够与全病毒发生抗原抗体反应，说明DEV clone-03UL27是病毒的组成成分，结合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区，以及UL27具有 跨膜糖蛋白特征，推测DEV clone-03UL6 测DEV全病毒，在大约88kDa处检测到特异性蛋白条带，与DNAStar软件预测DEV clone4)3 蛋白大小一致，结合其他研究报道，初步认为DEV UL6是病毒的结构蛋白。 戍用DNAStar软件对上述检测抗原性较好的DEVclone-03ULl9蛋白从蛋白的亲水性、抗原 性以及表面可及性进行表位预测，三段蛋白均存在抗原表位优势区，因此选取ULl9-C段蛋白制 备单克隆抗体．拟对ULl9抗原表位进行初步定位。将ULIg-C蛋白作为抗原免疫硒周龄的 blot和间接免疫 BALB／c小鼠，制备单克隆抗体，经过3次克隆，分别采用间接ELISA、Western clone-03 荧光方法筛选，最后得到4株(185、3A1、4F9、6F6)稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。将DEV 重叠．Western 特异性反应，说明获得的4株单克隆抗体都是针对ULl9-C1蛋白的，即在DEVclone-03