苏云金芽胞杆菌株bt11和gs8的研究.pdf

摘要 苏云金芽胞杆菌(Bt)是目前世界上应用最广的杀虫微生物，苏云金芽胞杆菌的 杀虫活性主要取决于其在芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白，从Bt菌株中分离克隆 杀虫基因，将有效开发利用我国丰富的杀虫基因资源，缩小国内外在Bt杀虫基因基础 研究领域中的差距，为工程菌和抗虫转基因植物的构建提供新的基因来源。本论文在 系统研究对鳞翅目害虫高毒力Bt菌株Btll和GS8生物学特性的基础上，围绕c删J『妇、 c秒J『胁和cry9Ea基因的分离、克隆、表达载体构建、杀虫活性测定以及杀虫机理等方 面进行了一系列的研究，主要内容包括： 形成菱形、球形和不规则形晶体。SDS．PAGE分析表明，Btll晶体主要由130kDa、 PCR—RFLP基因鉴定结果表明，菌株Btl 种基因类型。琼脂糖凝胶电泳分析表明，Btl1菌株含有5种质粒，GS8菌株含有4种质 粒。形态学和生理生化反应分析表明，Btll菌株与库斯塔克亚种(B．t 全一致，GS8菌株与东北亚种阻f subsp．tohokuensis)相同。 利用全长PCR方法，以Btl 质粒为模板扩增了洲J胁全长基因，完成了DNA序列测定。cry9Ea基因编码区全长为 5，为弱酸性 序列相似性为99．54％和99．77％，推测分子量为81．372kDa，等电点p16．21 nnmber分别 别被正式命名为cry9Ea6、c秽J血J4和c砂J『肋3。 和pET-1lb，SDS．PAGE矛I]Western 表达。蛋白可溶性分析表明，三种蛋自主要以包涵体形式存在。生物测定结果显示， (LCso值分别为2．0342 对小菜蛾初孵幼虫具有高毒力(LC50值为0．07631．tg／mL)。 iB。SDS．PAGE IA署I]pSXY—l PCR检测，证实获得了重组表达载体pSXY．9EA、pSXY．1 c删J肠3基因在受体菌HD73(cry-)中未检测到表达蛋白。利用等电点法提取晶体蛋白， 4．5741xg／mL)。 溶性分析表明，CrylIal4蛋白主要以包涵体形式存在，通过亲和层析方法纯化了 白的多克隆抗体，经分析两抗体的最佳效价为l：10，000。 Cry9Ea6的活性毒素，38kDa是Cryllal4的活性多肽。 够降解粉纹夜蛾围食膜上44kDa和30kDa左右的蛋白，破坏了粉纹夜蛾围食膜结构的 完整性，对甜菜夜蛾围食膜蛋白结构无明显的影响；Cryllal4蛋白对粉纹夜蛾围食膜 头)饲喂甜菜夜蛾五龄幼虫，12hr后围食膜依然可见，中肠壁略变薄，无太大变化。 得不完整； Cryllal4蛋白饲喂甜菜夜蛾12hr后，围食膜降解，食物与中肠界线不清， 中肠结构不完整。 根据Mg／EGTA方法，利用差速离心成功分离了甜菜夜蛾和粉纹夜蛾中肠 BBMV，CHAPS可以增加BBMV的溶解。经Western 些结果为进一步研究Cry蛋白的杀虫机理奠定了基础。 关键词：苏云金芽胞杆菌；基因克隆；Cry蛋白；杀虫活性：围食膜；中肠BBMV onBacillus strainsBtllandGS8 Study thuringiensis Applicant：LIUTmg-hm Major：PlantPathology WeiandProf．HUANG Supervisors：Prof．GUO Da-fang Abstract Bacillus oneofthemost usedinsecticidalmicrobes．The