盾壳霉t-dn插入体库的构建及两个分生孢子形成相关基因的克隆.pdf

摘 要 盾壳霉(Coniothyrium 介导高效转化盾壳霉的技术体系及克隆相关基因豹技术平台，构建了含30500个 转化子的T-DNA标记插入转化子库，克隆到2个与产孢相关的基因，现报道如下： 怼农杆菌转化条件进行了优化，建立了藏效转化震壳霉的技术体系。发现ZS—l 菌株的培养时间、用于转化的分生孢子浓度、分生孢子与农杆菌共培养的时间等 与转化效率有关。当使用在PDA斜面上培养21d所获彳导的分生孢子(浓度为108 个孢子／m1)与细菌共培养96h后获得的转化效率最高，每皿可以获得500个转化 cDNA文库等为基础的克隆基医的技术平台，并利用此技术平台克隆了产孢相关的 基因。 利用上述转化方法构建了盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA插入体库，获得了30500 个转化予。自盾壳霉的插入突变体库中共筛选得到了127株产孢缺陷型突变体， 其中弱株突变体在PDA平题上不麓产生分生孢子，焉另外的62株则可以产生少 量的孢予。这些产孢缺陷型突变体在菌丝生长速度、产抗生物质、寄生菌核能力 和菌落形态等方西存在差异显著性，大多数突变体的T-DNA为单位点播入，且插 入位点不同。这即表明盾壳霉的分生孢子形成复杂，受多种基因调控。依据菌落 形态，65株完全不产孢的突变体大致可分为?种类型，即I类：突变体生长缓慢， 菌落不能均匀扩展，共26株；II类：突变体生长较缓慢，气生菌丝茂盛，共28株； III类：突变体生长正常，但菌落中央的菌丝塌陷，溃解，仅1株：IV类：突变 体生长正常，但与寄主(核盘菌)接触后可以恢复产孢能力，共3株；V类：菌丝 生长块，甚至超过出发菌株ZS-I，熟5株；VI类：生长缓慢，菌丝稀疏，菌落中 有菌丝集结，呈铁锈色，仅圭株；Ⅶ类：突变体只能产生分生孢子器丽不产生分 生孢子，仅1株；另外还有ll株菌落形态上没有明显的区别，没有具体的归为哪 一类。 丝生长和分泌抗生物质等方殛与出发菌株ZS-I相比没有显著差异；此突变体仍具 寄生核盘菌的能力，在菌核上可以产生分生孢子，但其寄生腐烂菌核的能力显著 下降，显微观察发现ZS-1T2029的分生孢予形成停滞于分生孢子器原基阶段。 采用RNAi技术进一步证实CMCPSl与鹰竞霉孢予形成楣关。在PDA培葬基中添加 能合成精氨酸是ZS-1T2029不能产孢的原因。因此，精氨酸与盾壳霉分生孢子形 成相关。在PDA培养基中添加一氧化氮供体硝普钠(SNP)可恢复ZS一1T2029产孢， ．}蠹在PDA孛添翔一氧纯氮合成酶(鞭篱孪霉l铹栽L．磷基精氨酸甲酯(卜NAME)可{；盂 抑制ZS-1蒸撩产生分生斑子，试验结果表鹗精氨酸通过一氧纯氮调控藩壳霉的分 生孢子形成。进一步研究发现：一氧化氮在分生憨子器原基及分生孢予器中有大 量的积累，瓤在菌丝中累积不盟显；在PD8培养液中振荡培养，在zS一王翱 下降。 能力和分泌抗生物质等方面与出发菌株ZS-1相比没存显著差异。突变体与核盘蘸 菌落接触的地方及其菌核上均能够产生分生孢予，但在液体振荡培养时仅能形成 破坏了谷氮虢胺磷酸核糖焦磷羧转溅胺酶基因(CMAMPRSl)；穗泓麟乳懿全长 cDNA为1749 bp，含一个1560bp的完整阕读框架(鼹黔，该ORF编码含583令氨 基酸的蛋白质。CMAMPRSl在盾壳霉基因组中为单拷贝，RT-PCR结果显示此基嚣 在突变体ZS一1T21882中不表达，而在出发菌株ZS．1中有表达。谷氨酰胺磷酸核 糖焦磷酸转酰胺酶是生物体内从头合成次黄嘌呤中的第二个关键酶，研究发现在 与腺嘌呤有关。 关键词：农杼菌分导转纯(勰瓣)；盾壳霉；分生孢子形戒；核盘菌；生物防治： 氨甲酰磷酸合成酶；谷氨魏胺磷酸核糖焦磷酸转魏胺酶 n A8STRACT isan sclerotial of minitans mycoparasite Coniothyrium important Sclerotinia．二 sclerotiorum．Inthis efficient mediated dissertation，a