亚油酸异构酶基的克隆表达.pdfVIP

摘要 亚油酸异构酶基因的克隆表达 学科、专业：工科、食品科学 入学时间：2007年09月01日 硕士研究生姓名：朱敬华 答辩时间：2009年12月09日 指导教师：陈卫教授 授予学位时间： 摘 要 Linoleic 共轭亚油酸(ConjugatedAcid，CLA)是亚油酸(LinoleicAcid，LA)衍生的 共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有多种营养和保健功能，如抗癌、抗 动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、抑制脂肪积累等。由于利用微生物转化共轭亚油酸 反应条件温和，产物异构体较单一，易于操作和控制，研究者对此进行了广泛的研究， 发现亚油酸异构酶是生物转化共轭亚油酸的一个关键酶。随着研究成果的积累和分子生 物学技术的应用，研究的热点由对共轭亚油酸异构酶的微生物来源、酶学性质的研究逐 渐转向利用基因工程和生物信息学方法研究酶基因的克隆、表达以及表达产物的结构和 性质。 植物乳杆菌ZS2058(LactobacillusZS2058)是本实验室从泡菜中筛选到 plantarum 的一株具有产亚油酸异构酶的乳酸菌。根据NCBI中已报道亚油酸异构酶基因序列 coli E．coli BL21(DE3)和pET28a-LAU 进行了优化，确定最佳诱导条件为：IPTG浓度为0．1mol／L，20℃下诱导20 h。利用llis．tag 标签，通过镍柱纯化可溶性的外源蛋白，当洗脱缓冲液中咪唑的浓度为200mmol／L时 得到单一的目的蛋白。气相色谱(GC)检测显示，重组亚油酸异构酶没有活性。 lactis GG799。同时，用同样的方法构建阴性对照 GG799)，构建工程菌pKLACl．L舢俄lactis 菌pKLACl／K．1actis 了分泌表达，确定较佳的发酵时间为4d。气相色谱结果显示，重组菌培养液催化LA 反应产物出现典型CLA峰型。若忽略产物提取过程中损失的LA，约有26％的LA被异 构化为CLA。 此外，还考察亚油酸异构酶基因在乳酸菌系统中的表达，选择的表达载体和宿主菌 lactis 分别为pMG36e和乳酸乳球菌MGl363(LactococcusMGl363)。但在实验中发现 重组质粒pMG36e．LAI不稳定，在大肠杆菌中经数次传代后质粒会消失，因此不适用于 后续研究。 通过对亚油酸异构酶基因在三种不同表达系统中研究，最终确定乳酸克鲁维酵母作 本实验的宿主菌。亚油酸异构酶基因在乳酸克鲁维酵母中分泌表达的实现，避免了表达 摘要 产物被细胞内蛋白酶降解，为进一步将亚油酸异构酶基因引入食品级微生物内生产 CLA，从而开发保健功能性食品奠定了良好的理论和实验基础。 关键词：共轭亚油酸亚油酸异构酶表达系统分泌表达气相检测 II Abstract and oftheLinoleateisomerase Cloningexpression gene and Science Time