天然棕色棉纤维萄糖苷转移酶基因gh3gt的克隆与功能研究.pdfVIP

天然棕色棉葡萄糖苷转移酶基因Gh3GT 的克隆与功能分析 摘 要 棉花是世界上重要的经济作物 ,棉纤维是人类日常生活的必需品和纺织工业的重要原 料。彩色棉(colored cotton)又称有色棉 ,无需加工和染色可直接织成具有天然色彩纺织物, 是绿色环保产品,因此这种棉花又被称为 “生态棉”。但是天然彩色棉目前存在的共同问题 是:产量不高 ,纤维长度短，颜色偏少且色素遗传不稳定，所以培育天然彩色棉新品种 (系) 难度较大。因此，研究棉纤维色素发育的分子机理就显得极为紧迫。但迄今为止，对于棉纤 维色素发育的分子机理还知之甚少，克隆到的彩色棉纤维中特异表达的色素基因也为数不 多，还有很多纤维特异或优先表达的色素基因有待克隆和研究，这些工作不仅有助于深入了 解棉纤维色素发育的分子机理，同时也可以为基因工程改良彩色棉纤维品质和色泽品质提供 目的基因和理论基础。 本研究通过抑制性差减杂交方法从棕色棉纤维中克隆了一个600bp 的序列。通过3’RACE 和5’RACE 技术克隆到了基因的全长cDNA 序列，为1663bp，其开放阅读框全长1350bp，编 码含450 个氨基酸残基的蛋白序列。蛋白序列与糖苷转移酶基因的蛋白序列进行比对，此序 列C-端具有糖苷转移酶的所有保守氨基酸功能序列PSPG 功能域以及N-端的功能基团。通过 BLAST 比对，根据同源性和保守结构域将该基因命名为Gh3GT （GeneBank NO.eu921265）。半 定量RT-PCR 分析表明：该基因在棕色棉纤维中的表达量明显高于其他组织及其近等基因系 白色棉品种，且其在纤维中的表达规律与棕色棉的色素形成过程一致。该基因被定位于叶绿 体中。设计全长引物，得到了Gh3GT 的全长cDNA。构建了Gh3GT 的植物表达载体，经蘸花 转化法侵染了野生型拟南芥，转化了烟草BY-2 悬浮细胞，经烟草叶盘转化法转化了野生型 烟草。通过Kan 的筛选以及提取拟南芥基因组DNA，用PCR 的方法证实得到了转基因拟南芥 的阳性植株。观察发现，转基因拟南芥没有得到预想的花色的变化，但其生长速度比野生型 明显缓慢，生育期延长至三个月左右，且耐旱能力明显增强，植株大小及花色没有明显变化， 茎秆变扭曲；而转基因BY-2 悬浮细胞出现褐化，细胞紧密，不易摇开。推测Gh3GT 可能与 植物的生长发育以及逆境胁迫响应和防御有关，但Gh3GT 的具体作用机制目前还不清楚,还 有待进一步研究。 关键词：棕色棉；糖苷转移酶；RACE ；载体构建；遗传转化 I 天然棕色棉葡萄糖苷转移酶基因Gh3GT 的克隆与功能分析 Abstract Cotton is an important cash crop all over the world, and cotton fiber is necessary in daily life and indispensable as industrial material. Natural colored cotton can be directly made into colored texture without processing and dyeing, which is green, environmental protection product, so this kind of cotton is also called eco-cotton. But natural colored cotton share the same problem: low productivity, short fiber length, color shortage and unstable pigment, make it difficult to create new cultivars (lines). So it is urgent to study the molecular mechanism of cotton fiber development .But till now, it is sti