玉米弯孢叶斑病致病性分化定向选择机理与致病相关基因鉴定.pdfVIP

上海交通大学硕士论文 玉米弯孢叶斑病菌致病性分化定向选择机理与致病相关基 因鉴定 摘 要 玉米弯孢菌叶斑病是由新月弯孢霉（Curvularia lunata (Wakker) Boed ）引起的，自上世纪90 年代末，该病害在我国各玉米产区不断 蔓延，成为制约我国玉米安全生产的主要病害之一。关于该病害的发 生规律、品种资源抗性鉴定、病原流行学已有一些研究，然而关于寄 主对该病原菌选择效应和致病相关基因却缺少深入研究。 本文通过人工继代接种寄主和蛋白质组学技术相结合的方法，以 弱致病类型的玉米弯孢叶斑病菌（Curvularia lunata (Wakker) Boed. ） 瓦试 18 （WS18 ）和C107 为材料，反复接种（6 代）玉米抗病自交 系沈 135，Mo17 ，78599-1，分析病菌致病性动态变化。在接种前二 个世代，病情指数和菌丝蛋白图谱没有发生明显变化，到了第三代， 病情指数明显增加，蛋白质图谱的差异蛋白数量和表达水平也同步发 生变化。到接种第五代时，随着病情指数的增加，蛋白质图谱上的差 异蛋白数量大幅增加。利用 MALDI-TOP/MS 鉴定出 10 个差异蛋白 点，包括4 个上调蛋白、4 个下调蛋白和2 特异诱导蛋白。其中3 个 蛋白点与致病性分化密切相关，包括两个与黑色素合成相关蛋白（下 调蛋白Brn1, 上调蛋白Scytalone dehydratase）和1 个甘油合成相关 蛋白（上调蛋白NAD-dependent glycerol-3-phosphate ）；2 个过敏性相 1 上海交通大学硕士论文 关蛋白（上调蛋白 Serine/threonine protein kinase, 上调蛋白 Iron/manganese superoxide dismutases ），另外4 个蛋白参与了能量代谢 和信号转导过程（Triosephosphate isomerase, Phosphoglycerate mutase, RNB domain, Ran/TC4 subfamily ）。此外，还发现 1 种未知蛋白 (hydrolases or acyltransferases) 。这些特异诱导或表达上调的蛋白与致 病性分化关系密切，一方面可反映出抗病寄主对病菌的定向选择效 应，另一方面可做为致病性分化标记，为深入研究致病性分化机理提 供线索和技术方法。 关于病菌致病相关基因的研究，本文利用限制性内切酶介导基因 整合技术，用带有潮霉素和氨卞抗性基因的线性化质粒pv2 和限制性 内切酶HindⅢ转化经合适PEG 浓度处理的弯孢菌CX3 原生质体，构 建获得200 多个REMI 突变体，经选择性培养基继代培养筛选出 10 株遗传稳定的白色转化子，对这 10 株白化菌株进行致病性测定，接 种结果显示具有很弱的致病性，从而形成了优化的弯孢菌异源基因转 化体系。将单拷贝插入的白化菌株A －2 进行质粒拯救，得到的特异 性整合载体包含了430bp 的弯孢菌基因组DNA 序列信息，经NCBI 数据库检索发现，插入位点侧翼序列与不饱和脂肪酸脱氢酶（FAD3 ） 基因具有很高的同源性（93 ％），该酶是形成不饱和脂肪酸的关键酶 类，可能与病菌孢子和菌丝的形成与萌发相关。 关键词：玉米；弯孢菌；致病性分化；蛋白质组; REMI; 突变；白化； 质粒拯救 2 上海交通大学硕士论文 STUDIES ON THE MECHANISM OF DIRECTIONAL SELECTION OF CURVULARIA LUNATA VIRULENCE DIFFERENTIATION AND VIRULENCE GE