最新受体研究方法.ppt

受体概论之 受体研究方法 二、受体研究的内容 * 受体与配基的相互作用； * 受体的激活机制； * 后 续信号转导的启动机制； * 信号转导的路径； * 引起相应的生物学效应。 三、受体与配基结合反应的基本特征 *可饱和性 细胞特定的受体，数量有限。 *可逆性 内 解离；外 可逆和不可逆 *特异性和亲和力 配基、组织或器官特异 *和生物学效应相关 四、受体研究的意义 * 受体是调节细胞功能的有高度特异性的“门户”，而细胞功能的改变是乃许多疾病的基础，因此研究受体结构功能的改变和各种重要疾病发病机制的关系受到高度重视； * 寻找有高度选择性的药物一直是科学家的追求目标，受体的激动剂、拮抗剂以及调节受体结构和功能的药物正是这方面极有前途的研究对象。 * 从更深层次上看，受体和配给的结合属于研究蛋白质三维结构的重要内容，在分子生物学已进入后基因组时代的今天，这方面的研究有很重要的理论意义。 第一节 受体的放射配基结合分析 第一节 基本原理  ◆20世纪20年代末A.J.Clark发现药物效应与受体结合量呈正比且药物活性与受体亲和性有关。  ◆提出占领理论：受体与配基以单分子相互作用（分子比1：1），结核反应是可逆的，亲和性相同，配基在结合和解离后不被代谢，也不与其它类型受体结合，受体与配基结合产生的生物效应的强度与受体被占领的量成正比，受体结合反应平衡后服从质量作用定律。 ◆20世纪60年代初建立受体放射配基结合分 析（Radioligand Binding Assay of Receptors, RBA） 方法 受体放射配基结合分析法 一、放射性配基的制备 *对放射性配基的要求 ： 放射比活度高 亲和力高 特异性高 稳定性好 125I标记放射性配基的制备（可查相关文献） 1 氯胺-T法，N-氯代甲苯磺酰胺钠盐 2 Iodogen法，商品名为氯甘脲 3 乳过氧化物酶法 4 偶联标记法，标记游离氨基 受体标本的制备 1 组织切片 新鲜组织冰冻切片--离体放射配基结合反应—常规超薄切片—电镜自显影 2 完整活细胞 悬浮细胞：加入放射性配基进行结合反应，反应结束后取少量细胞，测量放射性。 贴壁细胞：待细胞长到90%左右去掉培养基，换为配基结合反应的缓冲液，不作成悬液，直接向贴壁细胞中加入放射性配基进行结合反应。 反应结束后，用冰冷的缓冲液洗去多余的游离配基，然后收集细胞，测定放射性。 3 亚细胞组分的差速离心法分离 全过程在4°C下进行。 组织匀浆—上清液– 上清液– 上清液（核受体） （800-3500g，~15分钟）---（10000-30000g，20min）--（100000g，60min） 注意问题： ●除去内源性配基和蛋白水解酶 ●受体标本保存，-70°C保存 ●受体蛋白从从膜结构或核中溶脱成可溶性受体，洗涤或用溶脱buffer。 第二节 组织化学（histochemistry）技术 免疫组织化学（免疫细胞化学）是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原（受体）能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。 近十年来，免疫组化技术发展很快，在现代医学的基础和临床研究中发挥着重要的作用，对疾病，尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病机理的研究提供了强有力的手段，但随着免疫组化标记物的增多和利用，原为特异的标记物并非绝对特异，而且出现交叉反应和异常表达的情况日益增多。故对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应在光镜观察组织形态的基础上，合理使用免疫组化技术，审慎判断其标记的意义。 缺点： 无法测定受体－配基反应的亲和性 免疫组化标记的形态学特征 免疫组化标记具有形态学特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断，现择要分述如下： 一、阳性标记色度特征 免疫组化标记时细胞阳性着色程度取决于抗原（受体）含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱阳性；棕黄色，为中等度阳性；棕黑色，示为强阳性。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学因素外，可能与细胞只有轻度异常表达，或某些细胞摄取了周围组织抗原之故。 二、阳性标记细胞学特征 免疫组化标记中，阳性标记细胞学特征是反映抗原（受体）在细胞中的定位和分