利用特定转录因的mrna诱导获得山羊ips细胞的研究.pdfVIP

利用特定转录因子的mRNA诱导获得 山羊iPS细胞的研究 研究生：邱峰龙 导师：李碧春 专业：动物遗传育种与繁殖 (扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009) 中文摘要 体细胞中导入特定的多能性转录因子可以将体细胞重编程为诱导性多能干细胞 stem cells，iPS)。截止到目前，已成功的获得人、牛、山羊、绵羊、 (Inducedpluripotent stem cells，ESC)类似的多能性等特性，该技术对于难以建立胚胎干细胞系的动物无疑提供了 一种可行的替代方案。但是，最初建立iPS细胞的传统方法是利用病毒载体将特定诱导因 诱导因子同时表达的细胞比例很低，且病毒载体会随机插入到体细胞的基因组中，可能导 致正常基因的表达受到影响，或引起基因突变并激活原癌基因的表达。质粒载体、多蛋白 表达系统、化学小分子以及转座系统虽然尽可能地减少了外源基因和病毒元件的整合，使 获得iPS细胞的安全性获得提高，但由于操作复杂、分析困难、制备效率低等原因制约着 优势：一方面避开了外源基因插入体细胞基因组的风险；另一方面诱导效率较上述方法提 高100倍，且细胞重新编程的速度提高了一倍。本研究利用mRNA诱导技术通过将山羊源 化，成功将山羊体细胞重编程为山羊iPS细胞。此外，利用优化的培养体系将诱导获得的 一株山羊iPS细胞成功传至22代。本文主要研究结果如下： 1．山羊iPS细胞相关的四个多能性转录因子的克隆与分析。 并合成相关特异性引物。采用RT．PCR的方法，从山羊胎儿生殖嵴、表皮和小肠组织获取 和91％，表明克隆获得的山羊各基因的序列正确。 2．不同pcDNA3．0真核表达载体的构建以及体外转录 pcDNA3．klf4和pcDNA3．c．myc真核表达载体。 按照体外转录试验的要求，成功获得“加尾”和“加帽”的各特异性转录因子的mRNA。 OSKC转录因子和EGFP的mRNA的浓度值分别为283．55ng／ul、274．81ng／ul、448．54ng／ul、 295．73 ng／ul、315．43 续转染试验的要求。 3．山羊iPS细胞诱导和培养体系的优化 本试验研究不同饲养层种类和培养液对山羊iPS细胞获得和培养的影响。结果显示，山 培养，一株山羊iPS细胞利用该培养体系己传至22代。 4．山羊iPS细胞的生物学特性 本试验诱导获得的山羊iPS细胞克隆呈集落性生长，克隆隆起呈岛状，细胞亮度高，边 缘整齐、光滑、折光性强，细胞排列紧密，与饲养层细胞边界清晰，与山羊ES细胞克隆、 羊iPS细胞体外延时培养可自发分化成类上皮细胞、类神经细胞和类脂肪细胞，体外悬浮培 养可形成类胚体。 5．mRNA诱导下的山羊体细胞重编程机制 均表明内源调控网络机制在mRNA转染12天后被激活。综上所述，转染后初期体细胞的重 转录因子的内源表达来维持。 关键词：山羊，转录因子，iPS细胞，重编程 IV ●一 ofGoatfibroblaststo StemCells Reprogramming Pluripotent mRNAofFour Factors Using Transcription M．S．Candidate：FenglongQiu Advisor：Prof．BichunLi and Genetics，BreedingRe