成年大鼠类胰岛细胞分离培养的研究.pdf

II 成年大鼠类胰岛干细胞分离培养的研究 摘 要 胰岛干细胞是一类存在于胎儿和成年胰岛内成体干细胞，具有自我更新和多分化 潜能，其特点是在自然分化过程中分化形成胰岛组织的各种细胞。采用干细胞组织工 程技术，体外分离克隆胰岛干细胞作为种子细胞，诱导其分化形成功能性胰岛细胞， 并移植治疗糖尿病，是解决胰岛供体短缺的有效途径。 本试验对成年大鼠类胰岛干细胞的分离培养、FBS 和四种生长因子对成年大鼠类 胰岛干细胞体外增殖的影响、成年大鼠类胰岛干细胞的主要生物学特性及其致瘤性等 方面进行了较为系统的研究，初步揭示了胰岛干细胞体外生长增殖的规律，建立了胰 岛干细胞体外培养体系，为利用胰岛干细胞技术生产具有医用价值的生物材料提供了 参考依据。本研究主要内容包括： （1）成年大鼠类胰岛干细胞的分离培养 本试验以成年大鼠胰腺组织为材料，采用机械剪碎结合0.1% Ⅳ型胶原酶消化分 离胰腺组织，DTZ 染色，挑取胰岛细胞团，以RPMI-1640 + 10% FBS + 10 mmol/L HEPES + 71.5 μmol/L β-巯基乙醇 + 1 mmol/L 丙酮酸钠为基础培养基进行培养，获得 原代上皮样成年大鼠类胰岛干细胞及少量的成纤维细胞。在传代过程中，逐渐纯化成 年大鼠类胰岛干细胞。 成年大鼠胰岛干细胞生长至70%～80%融合时，形成铺路石样细胞单层。前3 代 类胰岛干细胞增殖较慢，通常培养7 d 进行传代；第4 代以后类胰岛干细胞迅速扩增， 生长3～4 d 就可对其传代。由第5 代、第10 代和第 15 代类胰岛干细胞生长曲线可 知，细胞传代培养1d 后就进入快速增殖期，1～4 d 处于对数生长期，5～6 d 处于平 台期，7 d 后增殖能力开始下降。从成年大鼠类胰岛干细胞传代情况看，该干细胞有 较好体外增殖能力，现已传至30 代并冻存。染色体核型分析结果显示，第30 代的成 年大鼠类胰岛干细胞染色体的数量（2n=42 ）和形状均与第1 代的相同。 （2 ）FBS 和四种生长因子对成年大鼠类胰岛干细胞体外增殖的影响 以RPMI-1640 + 10 mmol/L HEPES + 71.5 μmol/L β-巯基乙醇 +1 mmol/L 丙酮酸 钠为基础培养液，分别添加不同浓度的FBS 、EGF、bFGF 、KGF 或IGF- Ⅱ，探讨血 清和不同生长因子对成年大鼠类胰岛干细胞增殖影响。结果显示，当FBS 浓度为15% 时，成年大鼠类胰岛干细胞增殖速度最快；在RPMI-1640 + 15% FBS + 10 mmol/L HEPES + 71.5 μmol/L β-巯基乙醇 + 1 mmol/L 丙酮酸钠的基础上，再添加10 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF 、5 ng/mL IGF- Ⅱ或15 ng/mL KGF ，均更有助于成年大鼠类胰 岛干细胞增殖，且细胞在添加10 ng/mL bFGF 的培养液中增殖速度最快。 （3 ）成年大鼠类胰岛干细胞的主要生物学特性及其致瘤性 随机取第15 代成年大鼠类胰岛干细胞，进行细胞免疫荧光染色和流式细胞术检 I 测。结果显示，第15 代成年大鼠类胰岛细胞表达Ngn3 、Nestin 、Pax4 、Pax6 和Oct4， 其阳性率分别为（90.6 ±3.2 ）%、（86.3 ±4.5 ）%、14.4%、7.7%和10.2%；不表达CK19、 Somatostatin、CD15、Nanog 、Sox2、CD117、Ptf1a 、MafA 和PCNA 。 7 取第26 代类胰岛干细胞，以1×10 个细胞/ 只（0.2 mL ）的量接种到4～6 w 裸鼠 的腋窝背部皮下，SPF 环境饲养30 d，观察裸鼠的生长情况。结果显示，该成年大鼠 类胰岛干细胞在裸鼠体内不具有明显致瘤性。 关键词：类胰岛干细胞，培养，增殖，分化，成年大鼠 II Study on Isolation and Culture of Adult Rats