家蚕免疫系统相基因的鉴定及其诱导表达模式研究.pdf

摘 要 家蚕免疫系统相关基因的鉴定及其诱导表达 模式研究 特种经济动物饲养专业 博士研究生程廷才 指导教师 向仲怀院士 夏庆友教授 摘 要 昆虫是地球上种类最多的动物群体，目前已报道的昆虫种类有100多万种， 在生态系统上占据重要地位。在进化过程中，昆虫显然已经进化形成了一套高效 的防御系统，用于抵御微生物的感染和寄生。除了保护色和机体物理屏障如角质 表皮、鳞毛或甲壳外，昆虫还具有识别和清除体内异物的高效免疫分子。免疫系 统研究是昆虫研究中最重要的基本问题之一，对于阐明生物的生长发育和起源进 化具有重要意义。 家蚕是典型的鳞翅目模式昆虫，也是一种完全依靠人类饲养才得以生存的重 要经济昆虫，其基础研究有着良好的积累，并保存有大量的突变体及繁育系。对 家蚕免疫相关基因的研究，不仅可以促进人们了解家蚕免疫应答的分子调控机制， 也可以促进人们对昆虫的分子调控机制的理解，并为昆虫免疫分子的多样性研究 提供线索。借鉴果蝇的免疫研究成果，利用家蚕基因组精细图、基因芯片和EST 等多种家蚕的数据资源，通过生物信息学分析，我们对家蚕的免疫系统相关基因 进行了鉴定，对一些关键基因进行了克隆，并对关键基因家族进行了比较和系统 进化研究，重点探讨了它们的免疫诱导表达模式和功能，最后对家蚕免疫应答的 分子机制进行探讨。获得的主要研究结果如下： 1．家蚕的免疫系统相关基因 采用果蝇和按蚊所有免疫相关基因在家蚕基因组中进行同源性分析的方法， 鉴定家蚕的免疫系统相关基因。我们鉴定了家蚕21个基因家族的218个免疫相关 基因，主要包括：(1)模式识别受体，如PGI心、GNBP、凝集素和清道夫受体等 两南大学博十学何论文 肽家族的基因。其中，大约65％的基因具有EST表达证据；大约90％的基因已经 定位到相应的染色体上，这为将来的基因功能研究提供了重要信息。系统进化分 析发现家蚕的免疫相关基因在昆虫中都很保守。模式识别受体和抗菌肽基因则具 有明显的物种特异性，在家蚕基因组中具有多个物种特异的拷贝，序列分化和物 种特异的基因重复现象明显，暗示它们受到更小的环境选择压力。同时，发现45 个家蚕一果蝇一按蚊一蜜蜂的1：1：1：1的直系同源基因，其中，信号传导途径的基 因都显示1：1：1：1直系同源关系，推测家蚕拥有与果蝇等其它昆虫类似的免疫应答 信号传导机制。 2．基于全基因组芯片的免疫诱导表达谱分析 本研究运用包含22987个基因探针的全基因组芯片，通过大肠杆菌(革兰氏 阴性细菌)和苏云金芽孢杆菌(革兰氏阳性细菌)诱导5龄第3天家蚕幼虫，在4 个时间点对脂肪体进行了转录组比较分析。芯片扫描结果显示，总共有9961个探 针有表达信号(信号值400)，占总探针数的43．3％，与此前的组织芯片结果相似。 个下调表达的基因。通过基因功能分类，结果显示上调表达的基因主要是免疫应 答相关基因，包括模式识别受体、抗菌肽基因、丝氨酸蛋白酶及其抑制剂相关基 因、黑化级联相关基因和调控铁元素代谢的基因等。而下调表达的基因主要是一 些能量代谢和生化酶类基因，包括细胞色素P450超家族的基因、表皮蛋白基因、 低密度脂蛋白、激素相关基因、动力相关蛋白编码基因，以及与常规代谢有关的 酶基因等。这种表达模式反映了昆虫脂肪体组织作为免疫应答器官的生理特征。 通过比较抗菌肽基因以抛c拥、册6Dc觑、删砌、聊D，纪加、彪6Dc伽和97D1旧一，l 等的诱导表达模式，发现在大肠杆菌诱导后抗菌肽基因诱导表达比苏云金芽孢杆 菌更迅速，前者在诱导的前2小时的诱导水平明显更高，但是后者诱导表达的最 大峰值却比前者明显更高。例如，鲫6Dc如J在苏云金芽孢杆菌诱导12小时后达到 99．49倍，比大肠杆菌的同一时间点高了近一倍；爿}钯c勘在苏云金芽孢杆菌诱导 12小时后也达到93．55倍，比大肠杆菌的高了4倍。由此推测家蚕对大肠杆菌和 苏云金芽孢杆菌的免疫应答具有细微差异。但总体上，比较大肠杆菌和苏云金芽 孢杆菌的诱导芯片结果，发现两种细菌诱导后的上调表达基因和下调表达基因非 常相似，并没有发现各自的特异表达基因，暗示了家蚕针对革兰氏阴性和阳性细 菌具有相似的免疫应答机制。 3．家蚕的ToI|相关受体基因家族