家蚕细胞色素p50基因及其定量方法的研究.pdf

家蚕细胞色素P450基因及其定量方法的研究 家蚕细胞色素P450基因及其定量方法的研究 中文摘要 细胞色素P450酶系又称作多功能氧化酶(MFO)，是广泛存在于所有需氧生物中 的一类代谢酶系，细胞色素P450基因起源于35亿年前的一个共同祖先，是最古老和 最庞大的超基因家族之一，在生命的过程中，它对内源物质的代谢与转化或外源化合 物的活化与降解等进行催化和调控。在昆虫基因组中大约有100个左右的P450s，它 们的作用涉及生长、发育、取食等过程，其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫 剂的抗药性和对植物有毒物质的耐受性，它还参与了昆虫体内保幼激素、蜕皮激素和 脂肪酸等内源化合物的合成与代谢。 morO是鳞翅目昆虫的模式生物，本研究以家蚕为研究对象，对家蚕 家蚕(Bombyx 用的内源参照基因进行分析，提出了新的定量PCR方法，并应用此方法，对家蚕和野 蚕(Bombyx瑚n如一加)部分P450基因进行了定量研究。本论文的主要研究结果如下： 1．家蚕P450基因cYP905BI的克隆及其结构分析 为了研究家蚕P450基因CYP305BI的结构，采用了反向PCR(inversePCR)技术， 全基因序列，并与野桑蚕P450基因CYP30581V1进行了比较分析。结果表明， CYP30581和CYP30581I1在5’UTR上游-400至-770之间370 bp的序列同源性只有 40．4％；在第l内含子中，与家蚕相比，野桑蚕在翻译起始密码ATG上游-340之前多 了330 bp间两者同源性也只有46．9％。这些结果为 bp的插入序列，而在一110至-340 深入研究该基因的功能提供了信息。 2．实时定量PCR方法的比较研究 rRNA，在实验样品中 为了比较目前常用的内源参照基因actin-3、GAPDH、28s 加入IFP2基因的mRNA和DNA混合物，作为跟踪标定基因，测定了家蚕各组织中的 acfin-3、GAPDH、28s rRNA基因的转录水平。同时测定了后部丝腺中的FibH、FibL 基因，中部丝腺Ser-1基因的转录水平，并对两种归一化方法进行了比较。 结果表明，actin-3、GAPDH、28srRNA在家蚕各组织中的差异极大，A3基因在 rRNA基因的转录水平以脂肪体最高(97，321)， 体最高(10，475)，中肠最低(6．57)。28S 家蚕细胞色素P450基因及其定量方法的研究 中文摘要 中肠最低(2，178)。 如用与actin-3、GAPDH、28srRNA相比的相对表达结果，则后部丝腺中的 测定方法，称为双跟踪标定定量PCR，所得结果称为基因的表观转录活性。 3．杀虫剂诱导的P450基因的表观转录活性 应用双跟踪标定定量PCR方法，测定了野蚕和不同品种家蚕P450基因的表观转 录活性。同时，测定了在杀虫剂敌敌畏和溴氰菊酯诱导下，家蚕L11和野蚕不同 P450基因的表观转录活性。 结果表明，家蚕品种菁松中P450基因主要在中肠中有较高的转录，其次是脂 肪体；家蚕品种皓月P450基因在丝腺中有较高转录；野桑蚕的P450基因的表观转录 水平，以丝腺最高，其次是中肠。 在敌敌畏和溴氰菊酯诱导下，L11中肠的P450基因的转录水平上调最显著， 菊酯诱导下，CYP9A19、C即鲋22均有显著上调，且达到较高转录活性，而在敌敌 畏诱导下野桑蚕被测P450基因未检测到较高的转录水平。 4．氟化物诱导下家蚕P450基因的表观转录水平 应用双跟踪标定定量PCR方法，测定了家蚕在NaF诱导下的P450基因的表观转 CYP30581，CYP4M5则在脂肪体中有较高表观转录活性。 实验表明，NaF诱导下的时间曲线有组织特异性，我们把中肠、脂肪体的诱导 称为正向诱导，这反映了家蚕对NaF的抵抗作用，把马氏管中的诱导称为反向诱导， 这反映了NaF对家蚕的毒害作用。并由此提出了在今后家蚕抗